結構生物化學/短RNA
短RNA在生物化學中起著重要作用。短RNA包括轉移RNA、小核RNA、微RNA和其他RNA。在本節中，我們將討論如何使用Helicos單分子測序技術來分析短RNA。為了延長RNA鏈，科學家使用剪接和3'端加工方法。還有許多非蛋白質編碼RNA的長度小於200nt；它們可以被稱為短RNA。
在RNA分離中，科學家希望從總RNA或培養細胞中純化sRNA。因此，他們使用某些材料來進行這項技術。它們是mirVana™ miRNA分離試劑盒、miRNeasy Mini試劑盒、RNA/DNA試劑盒。RNA/DNA試劑盒可用於從總RNA中分離大量sRNA。然後，人們使用TBE-尿素聚丙烯醯胺凝膠電泳和過夜洗脫從每個試劑盒中獲得sRNA。在製備cDNA的過程中，科學家使用大腸桿菌PolyA聚合酶和100 mM CTP底物。然後他們應用稱為ThermoScript的反轉錄酶過程。因此，使用5 M乙酸銨與苯酚、氯仿和異戊醇一起使用。並且還使用cDNA合成引物和RNase A。此引物的序列由整合DNA技術建立，其序列為 TCG CGA GCG GCC GCG GGG GGG GGG GGrG rGrG。在分析3'端sRNA時，使用稱為SuperScript III的反轉錄酶、USER酶、序列為TTTTUTTUTUTTTUTTTTUTTTUTTV的dTU-V cDNA合成引物、RNase H和RNase 1f。總的來說，這兩種方法在過程中使用了類似的材料。它們都使用了100%和70%的乙醇、10 mM dNTP、AMPure ®、1.5毫升管磁力架珠粒和PCR儀。在這些方法中還使用了RNase抑制劑。它們是ANTI-RNAse抑制劑或RNAseOUT抑制劑。在cDNA測序中，科學家使用20 U/ mL末端轉移酶、dATP、1 mM生物素-ddATP、10 mg/ mL牛血清白蛋白、Quant-tT™ OliGreen ® ssDNA試劑、NanoDrop 3300、HeliScope™單分子測序儀和Helicos ® 流式細胞儀
在開始分析短RNA之前，科學家必須瞭解實驗的目標。必須將所需長度的sRNA與長RNA分離。他們必須明白，只有一部分sRNA具有可用於將sRNA轉化為cDNA的mRNA的3'端polyA尾。此外，使用隨機六聚體只能在某些情況下用於將短RNA轉化為cDNA，因為RNA太短，無法順利完成轉化過程。一些RNA在其3'端和5'端具有修飾，這使得將它們轉化為cDNA更加困難。檢測sRNA有兩種方法。第一種方法檢測具有3'端-OH的sRNA。第二種檢測3'端-polyA sRNA。首先，使用不同的試劑盒分離sRNA。如果只需要小於200nt的sRNA片段，那麼mirVana試劑盒、miRNeasy或RNA/DNA試劑盒將很有用。TBEUrea變性聚丙烯醯胺凝膠電泳也可用於分離特定區域的sNRA。
分析sRNA的一般方法是透過在3'端新增polyC來修飾RNA。首先，他們將RNA放入含有30μL的PCR管中。此步驟中使用的短RNA量約為5ng至10ng。然後，他們在PCR儀中將試管在850C下孵育2分鐘，然後將試管放入冰中孵育2分鐘。向試管中加入10 mL的5×大腸桿菌PolyA聚合酶緩衝液；5 mL的25 mM MnCl2、1 mL的100 mM CTP、1 mL的Anti-RNAse或RNAseOUT，以及3 mL的2 U/ mL大腸桿菌PolyA聚合酶。因此，他們混合溶液並在PCR儀中在370C下孵育3小時。之後，在孵育的試管中加入40μL的水和10 μL的5M乙酸銨。然後，他們用苯酚、氯仿、異戊醇在試管中提取固體兩次。當他們在-800C下向試管中加入三倍於100% EtOH時，溶液會發生沉澱。最後，他們將在40C下將溶液離心30分鐘，並用70% EtOH洗滌沉澱物，然後真空乾燥固體。最後，你必須將固體放入30.5μL的水中。為了製備cDNA，他們首先將1 mL的100 mM cDNA合成引物加入到上一步驟中得到的30.5μL溶液中。然後，他們將在PCR儀中在700C下將溶液孵育2分鐘。在該溫度下，他們將向溶液中新增更多試劑，如10 mL的5倍ThermoScript cDNA合成緩衝液、5 mL的0.1 M DTT、2.5 mL的10 mM dNTP和1 mL的ThermoScript反轉錄酶。最後，需要將溶液孵育15分鐘以滅活反轉錄酶。在cDNA合成過程之後，他們會純化cDNA。首先，他們將合成的cDNA與1 mL的RNase A混合。然後混合AMPure珠粒懸浮液，以確保珠粒不會懸浮。然後，在cDNA和RNase的混合物中，加入150 mL的AMPure珠粒，並在室溫下孵育溶液30分鐘。因此，他們使用磁力架收集珠粒，並從溶液中去除固體。用200 mL的70% EtOH清洗溶液兩次，並在室溫下乾燥固體30到45分鐘。然後，他們用20μL的水清洗cDNA兩次。在開始分析短RNA之前，科學家必須瞭解實驗的目標。必須將所需長度的sRNA與長RNA分離。他們必須明白，只有一部分sRNA具有可用於將sRNA轉化為cDNA的mRNA的3'端polyA尾。此外，使用隨機六聚體只能在某些情況下用於將短RNA轉化為cDNA，因為RNA太短，無法順利完成轉化過程。一些RNA在其3'端和5'端具有修飾，這使得將它們轉化為cDNA更加困難。
分析sRNA的第二種方法是透過分析帶有polyA尾的RNA來製備cDNA。首先，將1 mL的50 mM dTU-V引物和1 mL的10 mM dNTP混合在一起。然後，使用熱迴圈儀將溶液在650C下孵育5分鐘。然後，將溶液放在冷鋁板上，並放置1分鐘。下一步是將溶液加入到2 mL的10倍SuperScript III反應緩衝液、4 mL的25 mM MgCl2、2 mL的0.1 M DTT、1 mL的SuperScript III和1 mL的RNAseOut中。將此混合物在850C下孵育50分鐘。下一步是從之前獲得的混合物中去除dTU-V引物序列。為了進行此反應，向混合物中加入1 mL的USER酶，並將溶液在370C下再次孵育15分鐘。然後向溶液中加入d 1 mL的RNase H和1 mL的RNAse。此溶液可用於下一步，即純化cDNA
在此反應中，將180μL的AMPure珠粒加熱至室溫。然後將珠粒新增到混合並孵育以製備cDNA溶液的溶液中。然後使用磁力架收集珠粒，並收集固體。然後用500 mL的70% EtOH清洗珠粒兩次。然後固體會被幹燥。最後，為了從珠粒中分離cDNA，向固體中加入20 mL的無核酸酶水。使用移液管去除液體，直到獲得cDNA固體。
使用末端轉移酶（TdT）透過polyA殘基阻止cDNA的3'端。為了進行此過程，他們需要製備cDNA的3'端。首先，他們在10.8 mL的水中獲得待尾部的cDNA（<10 ng）。然後，向混合物中加入2 mL的10×TdT緩衝液和2 mL的2.5 mM CoCl2，並將混合物在950C下孵育5分鐘。向孵育的溶液中加入4 mL的50 mM dATP、0.2 mL的BSA和1 mL的TdT。然後，將混合物在PCR儀中在700C下孵育60分鐘。將溶液放入冰中孵育2分鐘。然後，向冷溶液中加入1 mL的10×TdT緩衝液、1 mL的2.5 mM CoCl2、0.5 mL的200 mM生物素-ddATP、6.5 mL的水和1 mL的TdT。最後，將在PCR儀中在700C下孵育20分鐘