結構生物化學/單分子DNA測序
目前正在開發幾種單分子DNA測序（SMDS）技術，但只有迴圈合成單分子測序目前已發展到可以直接從單個DNA分子中以大規模平行方式產生序列資訊的程度。這種測序技術依賴於使用熒游標記的核苷酸，透過DNA聚合酶進入固定到表面的DNA互補鏈。單個DNA鏈被幾微米隔開，可以作為獨立實體進行監測。然後使用熒光顯微鏡依次檢測每個摻入的標記核苷酸的熒光訊號。由於每個DNA分子都是獨立測序的，因此不同分子之間不需要同步。數千萬個分子可以在單個小反應體積中平行測序，因此這種方法很容易以最低成本產生高通量測序。目前，該技術產生的讀取長度較短，使其適合於參考序列已知的重新測序應用。單個參考基因組可以作為由短DNA片段產生的數千個基因組的模板。這些資料可用於以高精度、高速度和低成本查詢多個目標環境中罕見的突變和遺傳異質性。提取大量序列資訊的能力將為癌症研究提供戰勝各種遺傳疾病所需的強大工具。
單分子測序是一個幾乎二十年來一直被追求的目標，它可能是取代Sanger測序法的候選方法。迴圈合成DNA測序（SBS）不同於Sanger方法，Sanger方法依賴於根據鏈中最後一個鹼基對具有特定顏色的擴增DNA鏈的長度進行分離。相反，在SBS中，合成本身隨後採用各種方法，這些方法並行監測許多反應，從而加快測序速度並降低成本。在所有迴圈延伸方法中，單分子測序具有最高的序列資訊密度，即單位面積的序列讀取數。
目前的Sanger測序方法需要大量的DNA進行復制，然後每次測序執行都是在一條序列上進行的，這是一條漫長而昂貴的路線。迴圈合成DNA測序提供的替代方案是並行測序數百萬個片段，而在迴圈合成SMDS中，根本不需要複製DNA。這種組合不僅會使全基因組測序便宜得多，而且會使其變得更快。這將允許對眾多基因組進行快速測序，並生成有用的統計比較。
迴圈合成SMDS的基本方案如下
1）DNA被剪下成短片段
2）這些片段被一個共同的DNA尾部延長
3）DNA片段被固定到含有與共同DNA尾部匹配的引物的玻璃表面上。
4）所有結合的片段然後透過以下方式並行測序 -
4a）用熒游標記的核苷酸將一個鹼基聚合酶延伸。
4b）透過TIRM檢測多個視野，以記錄數千萬個DNA片段上的摻入事件。
4c）去除染料分子。
4d）用不同的核苷酸返回到4a。
5）將每個序列的資料與已知序列進行比較並與其對齊。
6）來自這種比對的資料分析揭示了目標DNA中的序列資訊。
使用單分子熒光測序DNA需要仔細的實驗設計，以便能夠觀察到單個核苷酸摻入DNA模板。目標是單獨從每個分子中收集序列資訊。由於對多個視野進行成像以同時監測數百萬個模板上的摻入，因此應解決精確監測分子位置的技術。然後，應將每個分子的序列資訊與參考序列進行比對。對於足夠長的序列，即使存在分歧或“錯誤”，也可以將找到的序列與參考序列進行比對。“錯誤”可能來自測序中的真實錯誤，或者來自分析中的資料 - 即重新測序揭示的突變、多型性或異質性。為了獲得足夠的統計資料以提供有意義的DNA序列影像，需要過取樣，這可以平均隨機誤差，並揭示樣本的序列內容。由於同時測序的鏈數是巨大的，所以這不是該方法的嚴格限制。
迴圈合成SMDS是一種透過降低成本和提高通量來優於當前Sanger測序方法的技術。能夠以非常高的密度和高資料速率並行測序數百萬個鹼基，而無需同步摻入的約束，使這種方法成為大規模DNA重新測序應用的可行選擇。試劑使用的顯著減少，加上最小的樣品製備，有助於降低重新測序的成本和時間，以及幾乎消除擴增偏差。這種方法的微流體實現可以進一步降低試劑和整個裝置的成本。此外，在單分子熒光測序中使用Förster共振能量轉移作為區域性照明源，有助於減少核苷酸非特異性結合產生的噪聲和假陽性訊號，並且適用於其他需要嚴格限制的激發光的場合。使用可裂解熒游標記可以顯著提高單分子測序中的讀取長度，因為消除了相鄰染料之間的空間位阻相互作用。透過最佳化反應條件和選擇使用的DNA聚合酶，預計將進一步增加讀取長度。
Hebert，Benedict和Ido Braslavsky。單分子熒光顯微鏡及其在迴圈合成單分子測序中的應用。http://www.phy.ohiou.edu/~braslavs/articles/Book_Chapter_Hebert_and_Braslavsky.pdf