結構生物化學/穩定性、突變和可進化性

近年來，科學家們普遍認為蛋白質能夠耐受大多數氨基酸替換，但這一觀點已被新的概念所取代，即蛋白質突變的有害影響是限制蛋白質序列和功能變化的主要因素。本文分析了預測突變後穩定性影響的不同方法，以及用於彌補這些破壞穩定性（從而促進蛋白質進化）影響的不同機制。最廣泛接受的觀點是，蛋白質上的大多數位置能夠承受劇烈的序列變化，同時保持蛋白質的構型穩定性和功能。儘管這種觀點存在例外，但該假設認為穩定性與活性變化相關。2005 年，發表了兩篇論文，標誌著突變對蛋白質進化穩定性影響的重要性，隨後，人們對這兩篇論文進行了進一步研究，發現了蛋白質生物物理學與其分子進化之間的新聯絡。

蛋白質適應度

由於突變可以被描述為進化的“原材料”，因此為了持續維持現有結構和功能的選擇會消除大多數蛋白質突變，從而降低未來適應的可能性。這得出了一個結論，即發生的每個突變中只有一小部分會真正被固定在正向選擇下，以採用和維持一種新的功能。中性突變也被稱為“中性漂移”，它可以在小型種群中因隨機性而被固定。但對於生物體的層級來說，繁殖率（適應度，W）並不簡單，它們幾乎從不與一種基因或一種蛋白質的特性相關聯。由於冗餘、備份和穩健性在不同層級上的影響，突變的影響因此被掩蓋。基於這些原因，可以得出結論，突變的影響對於進化生物學家來說是一個難題。但是，一個方程可以用來展示蛋白質適應度的簡單模型。蛋白質適應度（W）是酶催化反應的波動，而這種波動又與這種特定酶發揮功能的生物體的適應度系統地相關聯。因此，這種持續的波動與功能性蛋白質的濃度 $[E_{0}]$ 及其功能 f（以比例表示）相關聯。

W=[E_{0}]f

研究表明，功能性蛋白質的濃度 $[E_{0}]$ 與蛋白質穩定性相關。約 ≥80% 的突變的有害影響源於它們對穩定性和摺疊的影響。當可溶性功能性蛋白質的水平降低時，就會導致蛋白質功能失常，而蛋白質功能失常則是由超過一定水平的破壞穩定性的突變引起的。透過對不同蛋白質進行實驗測量，證據表明突變有害的機率在 33-40% 的範圍內（平均為 36%）。因此，很明顯，隨著突變的積累，蛋白質適應度呈指數下降。這可以透過以下公式表示：

W≈e^(-0.36n)

以下等式表示隨著突變的增加，蛋白質適應度相應下降。n 是突變的平均數量。因此，當平均蛋白質積累時（平均約為 5 個突變），適應度將下降至 <20%。因此，蛋白質的初始穩定性可以抵消一些破壞穩定性的突變的影響，可以得出結論，蛋白質進化的速度取決於特定蛋白質的穩定性，因此，蛋白質進化的速度可能與獲得新功能有關。

熱力學穩定性

(∆G) 在各種模型中被用來描述進化，因為它是對穩定性的定義。因此，熱力學穩定性是指蛋白質的展開態和天然態之間的能量差，但這種熱力學穩定性測量僅適用於小蛋白質。但是，這種計算並不代表蛋白質在細胞環境中的穩定性。因此，動力學穩定性非常重要，因為它與蛋白質展開態和天然態之間摺疊中間體的能量水平相關聯，並且可以包括蛋白質的錯誤摺疊形式。此外，這些錯誤摺疊形式可能會導致聚集，如果不能被降解，就會造成問題。實驗資料表明，突變對熱力學穩定性的變化與僅適用於一小部分蛋白質的變化相關。但最近的研究表明，在計算方面取得了進展，使人們能夠預測各種範圍的蛋白質中突變的 ∆∆G 值。這些預測可以基於序列或蛋白質的 3D 結構，並且序列和 3D 結構的組合也被結合在一起。這種預測與突變對天然態的影響密切相關，因此不包括天然位點突變的影響。人們已經注意到，體內摺疊的影響與熱力學穩定性影響高度重疊。因此，對動力學穩定性影響的預測將具有重要價值。因此，對突變影響的更準確預測仍然是一個挑戰，因為這些影響與蛋白質水平有關，因為它們存在於體內。

穩定性與蛋白質適應度之間的關係

蛋白質適應度與突變之間的關係由以下等式決定：

W\propto [E_{0}]=1-{\frac {1}{e^{-{\frac {\Delta G}{RT}}}+1}}

這種 S 型關係表明，穩定性因子為 -3kcal/mol 時，超過 99% 的蛋白質會摺疊，而許多蛋白質的穩定性因子在幾個 k/mol 的範圍內。然而，低於 -3kcal/mol 的 ∆G 值會導致平衡偏離蛋白質的摺疊功能狀態。使用上述公式，穩定性因子小於 -3kcal/mol 表明一定量的蛋白質會發生錯誤摺疊或部分摺疊，這會導致聚集和降解的不可逆影響。

閾值模型

上述方程式還表明了一種關係，即蛋白質在導致其適應性下降之前，可以承受一定數量的突變。[E₀]（或蛋白質適應性，因為它們彼此成正比）只要 ΔG 仍然高於某個閾值，稱為 ΔG_t，如圖所示“閾值魯棒性模型”，就會保持固定。如果閾值要增加（綠色閾值魯棒性線），則對突變的耐受性會更高。然而，一旦突變開始積累，蛋白質適應性就會迅速下降。許多導致單基因疾病的突變表現出 S 型關係。

上位性效應

閾值模型體現了負上位性（當存在其他突變時，突變的有害影響會增加）。正如預期的那樣，前幾個突變對蛋白質適應性沒有或幾乎沒有影響，因為過量的穩定性緩衝了這些不穩定的突變。然而，更多突變的積累是累加的，會導致穩定性下降，最終導致適應性下降。負上位性效應表明，由於對蛋白質適應性沒有直接影響，因此自然選擇不利於較高的 ΔG 值。

環境魯棒性和表型突變

遺傳魯棒性可以用閾值模型來解釋，其中蛋白質在閾值（ΔG_t）增加時，對突變的耐受性更高。環境魯棒性是一個理論，解釋了為什麼蛋白質中會出現遺傳魯棒性。溫度、鹽度和其他環境因素的波動可能會影響更高穩定性的進化。另一個因素可能是表型突變。因為這些型別的突變比遺傳突變更頻繁地發生，所以表型突變被認為會對蛋白質適應性產生直接影響。因此，人們認為更高穩定性閾值的進化是為了緩衝表型突變和其他環境因素的影響。

梯度魯棒性

另一種對突變的魯棒性，梯度魯棒性，與較小的初始穩定性裕度相關，但斜率較小，因此每個突變平均會導致較低的穩定性損失。在一個沒有緊密堆積的蛋白質中，預計穩定性變化會更小，因為已經很少有殘基接觸，因此沒有太多相互作用可以丟失。事實上，來自 RNA 病毒的蛋白質表現出這種型別的關係。這些病毒的突變率比大多數其他生物高几個數量級。它們的蛋白質整體穩定性較低，並且經常鬆散堆積或部分無序。梯度魯棒性是指具有強大、緊密堆積結構的蛋白質比殘基接觸較少的蛋白質表現出更高的穩定性損失。

新功能和穩定性

適應性新功能突變通常發生在更埋藏的殘基中，比非適應性、中性突變更不穩定。如果這些型別的突變積累，蛋白質穩定性將低於 ∆Gt，從而降低 [e]o，最終降低蛋白質適應性。蛋白質獲得賦予新功能的突變的能力受到此類突變的不穩定效應的限制。觀察表明，改善了 TEM-1-乳糖酶對第三代抗生素的催化效率的突變是不穩定的，這表明蛋白質穩定性和新功能的進化之間存在權衡。另一方面，在功能發生變化後，經常會看到恢復蛋白質穩定性的補償性突變。FoldX 對新功能突變的預測表明，雖然新功能突變是不穩定的，但它們並不比平均突變更不穩定。觀察結果與這種預測相矛盾；發現新功能突變比中性突變更不穩定，並且通常更多地發生在內部殘基中。如果新功能突變積累，蛋白質穩定性可能會下降，導致蛋白質適應性下降，即使突變改善了功能。P450 和 TEM1 的穩定變體表現出更高的可進化性，因為它們能夠容納更多的新功能突變，而不會相應地降低酶水平。

穩定性和進化變化：上坡分化、下坡分化和伴侶蛋白

不同型別突變的蛋白質穩定性變化的進化變化的圖形表示。
綠色區域代表蛋白質穩定性，紅色區域代表不穩定性。藍色箭頭代表穩定性突變，橙色箭頭代表新功能突變（或不穩定性突變）。圖 B 中用黃色方框標記的區域代表伴侶蛋白緩衝。

上坡分化

補償性突變（或全域性抑制因子）恢復了進化蛋白質的穩定性裕度。補償性突變也被稱為全域性抑制因子，因為它們可以抑制各種突變的有害影響，並且在蛋白質的進化動力學中發揮著重要作用（在自然進化和體外進化中都觀察到）。大多數補償性突變是穩定的，例如，在對抗生素頭孢噻肟耐藥性的發展中，TEM-1 顯示出活性位點突變，這些突變提供了新的耐藥性，隨後是穩定性補償性突變 Met182Thr。進化速度受補償性突變恢復進化蛋白質的穩定性所需時間的限制。儘管如此，改變蛋白質功能並且比 ∆Gt 更不穩定的突變無法固定，除非受到伴侶蛋白的緩衝。

穩定性祖先/共識突變和下坡分化

透過將補償性突變（穩定性因子）與新功能突變（不穩定性因子）配對，蛋白質的整體穩定性得以維持。然而，過量的穩定性可能會阻礙可進化性，因為蛋白質變得僵硬，限制了可能解釋新功能的替代構象。在蛋白質工程中使用下坡分化的一個方法是將補償性突變納入用於選擇酶新功能的庫中；但是，這將需要能夠預測穩定性補償性突變。在一箇中性漂移實驗（多輪突變和純化以保持酶的功能），該實驗為預測穩定性補償性突變提供了提示，幾種不同的突變得到了富集，其中五種顯示最高富集的突變提高了穩定性，並充當了一系列不穩定性突變的補償性突變。富集的突變有一個共同點：它們都將 TEM-1 的序列改變得更接近其家族共識，或其祖先。如果突變發生在保守的殘基中，它通常會導致穩定性大幅下降，而透過恢復偏離共識氨基酸的殘基可以提高穩定性。祖先干擾和/或共識分析可以用來預測補償性突變。然後，這些預測的補償性突變可以用來透過下坡分化促進具有新功能的更穩定蛋白質的工程化。

伴侶蛋白和蛋白質可進化性

已知伴侶蛋白可以幫助蛋白質摺疊，但它們也可以緩衝突變的影響。雖然對進化速率的程度和影響尚不清楚，但伴侶蛋白似乎擴大了中性區，允許不穩定性突變的積累。最近建立了一種測量細菌伴侶蛋白 GroEL/ES 緩衝能力的方法，其中在 GroEL/ES 蛋白過表達的情況下進行了突變積累實驗。然後測試積累突變的蛋白質以確定獲得的突變的數量和型別以及穩定性所需的緩衝量。發現，在 GroEL/ES 過表達的情況下，積累的中性突變數量增加了一倍，可變性也增加了。蛋白質核心中的突變水平增加，並且這些突變平均比沒有 GroEL/ES 的情況下具有更高的不穩定效應。還表明 GroEL/ES 的過表達可以加速新的酶特異性的獲得。在一個案例中觀察到，在 GroEL/ES 過表達下選擇的酶變體具有一個突變，該突變在很大程度上改善了正在進化的新的活性，但也非常不穩定。沒有 GroEL/ES 選擇的變體帶有另一個突變，該突變顯示出較低的改進，沒有不穩定性，而沒有伴侶蛋白過表達選擇出的變體沒有顯示出改進的功能，甚至由於酶濃度較低而導致功能下降。

已知伴侶蛋白（GroEL）使用 ATP 來幫助蛋白質摺疊。該過程包括未摺疊的蛋白質與 GroEL 結合，而不會阻斷 GroES。然後，ATP 將與 GroEL 七聚體結合，這將導致 ATP 水解。ATP 水解包括釋放 14ADP 和 GroES。從這裡開始，GroEL 然後與 7ATP 和 GroES 結合在口袋中，這將允許蛋白質在內部摺疊。從口袋中釋放的蛋白質意味著它們是完全或部分摺疊的，而未摺疊的蛋白質被送回與 ATP 結合。

參考文獻

Tokuriki, Nobuhiko 和 Dan S. Tawfik。 “突變的穩定性效應和蛋白質可進化性”。《結構生物學當前觀點》19.5 (2009): 596-604。印刷版。