結構生物化學/T4 DNA 連線酶

DNA 連線酶是一種特殊的連線酶，它可以透過建立磷酸二酯鍵將兩條在互補鏈中都斷裂的 DNA 鏈連線在一起。DNA 連線酶在 DNA 修復和 DNA 方面都有應用。此外，它在分子生物學實驗室中被廣泛用於遺傳重組實驗。DNA 連線酶是生成重組 DNA 序列的有用工具。例如，DNA 片段用限制性內切酶切割，然後用 DNA 連線酶重組。DNA 連線酶通常存在於大腸桿菌中。

T4 DNA 連線酶是一種由稱為 T4 的噬菌體編碼的酶。在 DNA 分子在 3'-羥基和 5'-磷酸末端連線在一起的反應中，連線酶被用作催化劑。鑑於修復反應中沒有缺失的核苷酸，連線酶也可以催化 DNA 雙鏈中兩個片段的共價連線，形成一個不間斷的鏈。為了實現這種催化活性，需要 ATP 和 Mg²⁺。缺少必需磷酸殘基的 DNA 仍然可以透過用 T4 多核苷酸激酶磷酸化而連線。此外，連線酶還可以催化焦磷酸與 ATP 之間的磷酸交換反應。

來自大腸桿菌溶原菌 NM989 的 T4 DNA 連線酶的特徵

T4 DNA 連線酶是一種單一多肽，分子量為 68,000 道爾頓。為了獲得連線酶的最大活性，需要 pH 值為 7.5-8.0。在 pH 值分別為 6.9 和 8.3 時，該酶分別表現出其全部能力的 40% 和 65%。如前所述，Mg²⁺ 是 T4 DNA 連線酶發揮作用所必需的，而 Mg²⁺ 的最佳濃度為 10mM。巰基試劑 (DTT、2-巰基乙醇) 也是使用該酶所必需的。如果存在 NaCl，濃度超過 200 mM 將阻止所有酶促反應發生。對於分子間連線，特別是當底物 DNA 由大的 DNA 分子組成時，PEG（濃度為 1-10%）似乎會刺激酶活性。

應用

T4 DNA 連線酶主要用於將具有相容粘性末端的 DNA 分子連線起來，或者將鈍端雙鏈 DNA 連線在一起，或連線到合成接頭。涉及鈍端 DNA 的反應比其他反應慢，但透過新增 150 至 200 mM NaCl 和低濃度的 PEG 可以加速連線速度。如果 DNA 中缺少 5' 磷酸，則在連線之前需要進行磷酸化。磷酸化是透過使用 T4 多核苷酸激酶與 ATP 實現的。如果要連線在一起的 DNA 片段具有彼此不相容的突出的 5' 末端，則仍然可以透過使用大腸桿菌 DNA 聚合酶 I 的克萊諾片段在受控反應中部分填充凹陷的 3' 末端來連線這兩個片段。