結構生物化學/T4 多核苷酸激酶

描述

T4 多核苷酸激酶 (T4 PNK) 催化從 ATP 轉移磷酸基團到單鏈和雙鏈 DNA 和 RNA 以及寡核苷酸的 5'-OH 基團。該反應是可逆的。該酶也是一種 3'-磷酸酶和同源四聚體。它由四個 28.9 kDa 的相同亞基組成。T4 多核苷酸激酶可用於限制性內切酶的緩衝液中，用於 PCR 等技術。它可以在大腸桿菌中找到，具有噬菌體 T4 的重複基因。它也可以用於標記核酸的 5'-末端，這些末端可用作雜交探針、轉錄圖譜；凝膠電泳的標記物。它們還可以用作 DNA 測序和 PCR 技術的引物，以及一種去除 3'-磷酸基團的酶。

儲存

T4 多核苷酸激酶應儲存在 -20°C。

應用

T4 多核苷酸激酶用於標記核酸的 5'-末端，標記後的產物可用於以下方式：- 凝膠電泳的標記物 - DNA 測序的引物 - PCR 的引物 - 雜交探針 - DNA 和 RNA 連線酶的底物 - 轉錄圖譜的探針 寡核苷酸連線子和 DNA 或 RNA 的 5'-磷酸化是在連線反應進行之前所需的。使用 ³²P-後標記測定法，可以檢測到 DNA 修飾。

其他

核酸的 5'-末端可以透過正向反應或交換反應進行標記。當進行正向反應時，[³²P 或 ³³P]-ATP 中的磷酸基團被轉移到 DNA 或 RNA 的 5'-羥基末端。但是，如果核酸已經包含 5'磷酸基團，則可以透過使用小牛腸鹼性磷酸酶或細菌鹼性磷酸酶將其去除。當進行交換反應時，核酸 5'-磷酸基團被轉移到 ADP，然後來自 [³²P 或 ³³P]-ATP 的放射性標記磷酸基團被轉移到不含 5'-羥基的核酸。用於交換反應的理想緩衝液是咪唑-HCl 緩衝液，pH 值為 6.4。PEG 用於提高激酶反應的速度和效率，應新增到交換反應中。當存在磷酸根和銨離子時，T4 多核苷酸激酶會被抑制。在磷酸化反應之前，如果存在銨離子，則不應沉澱 DNA。