T4 RNA 連線酶透過形成 3'→5' 磷酸二酯鍵催化 5' 磷酸化末端的核酸供體與 3' 羥基化末端的核酸受體的連線，同時水解 ATP 生成 AMP 和 PPi。底物包括單鏈 RNA 和 DNA，以及二核苷酸焦磷酸酯。這種連線酶可由包含質粒 pRF-E35 的純化的 E. coli 菌株 ER2497 形成。此酶用於用 5’-[32P] 標記 RNA 的 3' 末端。它作為 RNA 與 DNA 分子的分子內和分子間連線起作用。它還可以用於合成單鏈寡脫氧核糖核苷酸，並將額外的氨基酸結合到蛋白質中。