蛋白質組學/蛋白質分離 - 色譜法
介紹
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章節作者：Laura Grell 和 Alexander Butarbutar
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章節修改者：Kai Burnett 和 Dalia Ghoneim
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引言
(Res1) 為了獲得純的蛋白質樣品，必須將蛋白質與所有其他蛋白質和細胞成分分離。這可能是一項艱鉅的任務，因為單個蛋白質通常只佔細胞總蛋白質濃度的 1%。因此，在將其歸類為純淨之前，必須去除樣品中 99% 的蛋白質成分。同樣具有挑戰性的一項任務是保持蛋白質的活性形式。當我們純化蛋白質時，我們將其從其自然環境中移除。因此，有必要模擬蛋白質通常存在的 pH 值、鹽濃度和還原條件。在獲得活性且純淨樣品的過程中，我們希望儘量減少步驟數量，以便最大限度地提高分離結束時的產量。最後，由於蛋白質的製造意圖是在短時間內發揮作用，因此儘快獲得樣品也至關重要。所有這些蛋白質分離元件都可以透過一組分離方法成功實現，這些方法統稱為 色譜法。
蛋白質具有多種特性，可以利用這些特性來分離蛋白質。不同的色譜型別利用不同的特性。蛋白質可以透過以下方式分離
- 大小
- 形狀
- 疏水性
- 對分子的親和力
- 電荷
在本章中，將介紹和描述幾種不同的色譜方法。雖然下面概述的方法都利用了蛋白質的不同特徵來將蛋白質彼此分離，但它們都使用不溶性固定相和在固定相上流動的流動相。流動相通常是液體溶液。它包含我們想要分離的蛋白質。另一方面，固定相由一組珠子組成，通常基於碳水化合物或丙烯醯胺衍生物，這些珠子與離子帶電物種、疏水性特徵或親和力配體結合。色譜成功的很大一部分與選擇合適的固定相有關。
在 柱色譜法 中，當蛋白質樣品被施加到色譜柱上時，它會在固定相和流動相之間平衡。根據色譜型別的不同，具有某些特徵的蛋白質將與固定相結合，而缺乏所尋求特徵的蛋白質將保留在流動相中並透過色譜柱。例如，在離子交換色譜中，帶正電荷的蛋白質將與帶負電荷的固定相結合，而帶負電荷的蛋白質將與流動相一起從色譜柱中洗脫。最後一步包括透過引入一種與蛋白質在固定相上的結合位點競爭的顆粒，將蛋白質從固定相中置換出來，也稱為洗脫。如今，各種商業化色譜柱 readily available，特別是 Bio-Rad、Sigma-Aldrich、GE Healthcare 和 Omnifit 提供了各種色譜柱。
上面的影像是色譜圖，它顯示了基於檢測器解釋的訊號的分離結果。
tm - 流動相穿過色譜柱整個長度所需的時間
tr - 特定蛋白質從色譜柱中洗脫所需的時間
資源
- Craig, P. 設計分離
- 佛羅里達州立大學，“色譜法” Michael Blaber 的生物化學實驗室
- GE Healthcare - [1] - [2]
- BioPharm International Guide 色譜基礎 (2003)。
- Bio-Rad 色譜蛋白質純化 || 綠色熒光蛋白色譜試劑盒
- BioForum 色譜主題
- 色譜科學雜誌
- M.Isabel Pedraza Mayer 色譜資料庫
參考文獻
- Harris, D.C. "Quantitative Chemical Analysis; 6th Edition", W.H. Freeman and Company: New York..
- Patrick McKay 色譜簡介 Genentech, Inc. 恢復科學部高階研究助理 *。
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