蛋白質組學/蛋白質分離 - 色譜法
介紹
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章節作者：Laura Grell 和 Alexander Butarbutar
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章節修改者：Kai Burnett 和 Dalia Ghoneim
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引言
(Res1) 為了獲得純的蛋白質樣品，必須從所有其他蛋白質和細胞成分中分離出蛋白質。這可能是一項艱鉅的任務，因為單個蛋白質通常只佔細胞總蛋白質濃度的 1%。因此，在樣品被歸類為純淨之前，必須去除 99% 的蛋白質成分。同樣具有挑戰性的任務是保持蛋白質的活性形式。當我們純化蛋白質時，我們將它們從其天然環境中移除。因此，有必要模擬它們通常所處的 pH 值、鹽濃度和還原條件。在獲得活性且純淨的樣品的過程中，我們希望最大限度地減少步驟數量，以最大限度地提高分離結束時的產量。最後，由於蛋白質是為僅在短時間內發揮作用而製造的，因此儘快獲得樣品也至關重要。所有這些蛋白質分離元件都可以透過一組統稱為色譜法的分離方法成功實現。
有幾種可以利用的蛋白質特性來分離蛋白質。不同的色譜型別利用不同的特性。蛋白質可以根據以下標準進行分離：
- 大小
- 形狀
- 疏水性
- 對分子的親和力
- 電荷
在本章中，將介紹和描述幾種不同的色譜方法。雖然下面概述的方法都使用蛋白質的不同特徵將蛋白質彼此分離，但它們都利用不溶性固定相和流過它的流動相。流動相通常是液體溶液。它包含我們要分離的蛋白質。另一方面，固定相由一組珠子組成，通常基於碳水化合物或丙烯醯胺衍生物，這些珠子與離子帶電物種、疏水特性或親和配體結合。色譜法的很大一部分成功與適當固定相的選擇有關。
在柱色譜法中，當將蛋白質樣品施加到色譜柱時，它會在固定相和流動相之間達到平衡。根據色譜法的型別，具有某些特徵的蛋白質將與固定相結合，而缺少所尋求特徵的蛋白質將保留在流動相中並透過色譜柱。例如，在離子交換色譜法中，帶正電荷的蛋白質將與帶負電荷的固定相結合，而帶負電荷的蛋白質將與流動相一起從色譜柱中洗脫。最後一步涉及透過引入一個與蛋白質在固定相上的結合位點競爭的粒子來從固定相中置換蛋白質，也稱為洗脫。如今，各種商業色譜柱唾手可得，尤其是Bio-Rad、Sigma-Aldrich、GE Healthcare 和Omnifit 提供了各種色譜柱。
上圖是色譜圖，它顯示了根據檢測器解釋的訊號進行分離的結果。
tm - 流動相流過色譜柱的整個長度所需的時間
tr - 特定蛋白質從色譜柱中洗脫所需的時間
資源
- Craig, P. 設計分離
- 佛羅里達州立大學，“色譜法” Michael Blaber 的生物化學實驗室
- GE Healthcare - [1] - [2]
- BioPharm International Guide 色譜法基礎 (2003)。
- Bio-Rad 色譜法蛋白質純化 || 綠色熒光蛋白色譜法試劑盒
- BioForum 色譜法主題
- 色譜科學雜誌
- M. Isabel Pedraza Mayer 色譜法資料庫
參考文獻
- Harris, D.C. "Quantitative Chemical Analysis; 6th Edition", W.H. Freeman and Company: New York..
- Patrick McKay 色譜法簡介 Genentech, Inc. 回收科學部高階研究員 *。
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