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蛋白質組學/蛋白質分離- 電泳/電泳簡介

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凝膠電泳
電泳簡介

電泳簡介

定義

電·泳·（ĭ-lĕk'trō-fə-rē'sĭs）n. [1]
1) 帶電膠體粒子或分子在施加電場（通常由浸入的電極提供）的作用下透過溶液的遷移。也稱為電泳。
2) 一種分離物質（尤其是蛋白質）和分析分子結構的方法，基於每種成分在膠體懸浮液中在電場作用下的運動速度。


分·析·物 (a-nə-līt) n. [2]
化學分析的化學物質。

電泳理論

電泳分離取決於離子或溶質在給定介質中在電場中遷移速度的差異。分析物的電泳遷移速度為

其中 E 是電場強度， 是電泳遷移率。


電泳遷移率與緩衝液中的摩擦力成反比，與分析物的離子電荷成正比。分析物所受的摩擦力取決於分析物的尺寸和介質的粘度 (η)。當分析物透過緩衝液移動時，具有不同摩擦力或不同電荷的分析物會彼此分離。在給定的 pH 值下，分析物的電泳遷移率為

其中 r 是分析物的半徑，z 是分析物的淨電荷。


分析物電荷與尺寸比率的差異會導致電泳遷移率的差異。小而帶高電荷的分析物具有更高的遷移率，而大而帶低電荷的分析物具有更低的遷移率。電泳遷移率是分析物在給定介質中遷移速度的指標。作用在分析物上的淨力是兩種力的平衡：有利於運動的電力和不利於運動的摩擦力。在電泳過程中，這兩種力保持穩定。因此，在給定的條件下，電泳遷移率對於給定的分析物是一個常數。[3]

電泳的應用

電泳在蛋白質組學、法醫學、分子生物學、遺傳學、生物化學和微生物學中具有廣泛的應用。

電泳最常見的用途之一是分析基因的差異表達。健康細胞和患病細胞可以透過其蛋白質的電泳模式差異來識別。蛋白質本身也可以透過這種方式進行表徵，並且可以從凝膠中片段的質量推斷出它們結構的一些資訊。 [4]

存在許多不同的電泳型別，每種型別都可以用於不同的目的。例如，二維 (2-D) 電泳能夠識別比大多數同類方法更多的蛋白質。本章將詳細討論這些方法中的許多方法。

參考文獻

  1. ^ 美國英語遺產詞典，第四版。 http://www.bartleby.com/61/
  2. ^ 梅里亞姆-韋伯斯特線上詞典。 http://www.m-w.com
  3. ^ Mans，Andreas 等。生物分析化學。帝國理工學院出版社，2004 年。
  4. ^ Twyman，Richard。“二維聚丙烯醯胺凝膠電泳。” http://genome.wellcome.ac.uk/doc_wtd021045.html

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微流體電泳

蛋白質組學將從微流體中獲得什麼？

蛋白質組學對影響生物體行為的蛋白質及其功能的發現做出了重大貢獻。最近的研究集中在它在單細胞和組織水平上探索蛋白質的作用，因為它們代表著每個人的指紋，特別是在疾病表現的方式方面。[1] 由於單細胞或組織的樣本量有限，因此在這些水平上研究蛋白質組對常規臺式儀器來說是一個巨大的挑戰。為了促進這種水平的研究，微流體技術被引入並發展成為蛋白質組學必不可少的工具。

除了能夠處理少量樣品外，微流體技術在微型化整個系統方面發揮著重要作用。結果，可以實現更好的效能，例如更少的材料消耗、更快的處理時間、更自動化和更低的成本。這種微尺度的另一個優勢是樣品和試劑之間的混合變得更加有效。[2] 通常需要幾個小時才能完成的某些化學過程可以在幾分鐘內完成。這種優勢使基於微流體的免疫測定能夠用於監測疾病的進展。[1] 並且，隨著成本的降低，微流體裝置成為許多即時檢測應用的理想選擇。[3]

微流體技術提供的最令人著迷的功能之一是它與其他系統（尤其是質譜儀）的高度整合能力。[4] 各種檢測的多路複用是另一個例子。這種多路複用潛力使基於微流體的裝置成為（生物）化學和生物醫學中的高通量解決方案。[5]


微流體微系統中的電泳

將生物技術與微流體相結合使操作非常小的生物液體體積不僅可行，而且非常有效，尤其是在電泳方面。最近的研究和開發工作集中在發明一種完全自動化的電泳微系統，該系統易於根據特定需求定製，並提供與金標準一致的結果。這種微流體微系統通常被稱為晶片實驗室。在分析（生物）化學中使用的微流體微系統中，最廣泛使用的方法來控制生物分子或分析物的運輸是凝膠電泳或毛細管電泳。

儘管兩種技術都利用了蛋白質、肽和 DNA 等生物分子在緩衝液中帶電的特性，但微流控凝膠電泳在流體動力學方面與毛細管電泳有所不同。在微流控凝膠電泳中，多孔凝膠介質的存在阻止了微流控通道中的整體流動。[3] 另一方面，在微流控毛細管電泳中，整體流動成為了影響分析物電動力學的工程因素，因為需要考慮電滲流的存在。[6] [7] 從分析的角度來看，它們的電泳分離方法也有所不同。凝膠基電泳分離生物分子是基於大小或分子量的差異，而毛細管基電泳分離則是利用生物分子之間電荷與質量比的差異。

與金標準方法相比，微流控凝膠電泳和毛細管電泳獲得的分析結果與傳統的平板凝膠[8] 和毛細管電泳[5] 分別獲得的結果一致。然而，在設計和應用的角度來看，這兩種方法有一些優勢和劣勢需要考慮。在工程設計方面，微流控凝膠電泳系統更容易根據特定應用和多路複用進行定製，因為不需要考慮整體流動的影響。這使得將樣本預處理等額外功能整合到微流控凝膠電泳中變得更加直接。[3] 然而，由於毛細管基微系統不需要凝膠篩分介質，因此微流控毛細管電泳裝置的可重複使用性遠高於凝膠基對應物。在生物（分析）應用方面，微流控毛細管電泳有一個缺點，即它在分析電荷與質量比相似的帶電粒子時表現不佳。[3] 值得注意的是，一些微流控毛細管電泳系統能夠與質譜儀直接連線。[5]

本章將詳細介紹微流控凝膠電泳和毛細管電泳的器件製造工藝、基本工作原理以及一些臨床應用。儘管本章主要關注微流控電泳，但也包括了樣本預處理、檢測和定量過程等額外功能的整合。毫無疑問，這種整合是透過微流控技術實現的。


微流控凝膠電泳

在凝膠電泳中利用微流控技術，在許多方面為蛋白質組研究提供了傳統方法無法實現的優勢。更快的處理時間、更靈敏的檢測、更自動化的操作和高度整合的系統是使用微流控的主要優勢。此外，微流控技術使凝膠電泳系統能夠輕鬆地針對特定應用進行定製。例如，可以設計一個微流控凝膠電泳系統，使片外處理能夠消除。事實上，它可以整合到基於微流控的系統中。樣本製備的整合是一個切實可行的例子，它不僅簡化了實驗方案，而且提高了檢測靈敏度。[1]

本節專門介紹用於免疫測定的定製微流控凝膠電泳。[3] 將詳細討論重要的方面，例如製造工藝、工作原理和臨床應用。


一、製造工藝

凝膠電泳可以使用微流控技術針對特定的分析研究（例如免疫測定）進行定製。下面將介紹的微流控凝膠電泳免疫測定的定製製造工藝基於 Herr 等人使用的器件。[1] [3] 在他們的研究中，抗體被用作報告物來檢測特定蛋白質（作為抗原，可能是一種疾病生物標誌物）的存在。下面將逐步介紹製造過程。


步驟 1：製造尺寸排阻膜[3]

步驟 1：製造尺寸排阻膜

材料:

  1. 脫氣 22%（15.7:1）丙烯醯胺/雙丙烯醯胺（6% 雙丙烯醯胺交聯劑）
  2. 0.2%（w/v）VA-086[9]（光引發劑）
  3. 1X Tris/甘氨酸緩衝液

微流控凝膠電泳免疫測定的第一個製造元件是尺寸排阻膜。該膜用於增強分析物濃度，從而提高檢測靈敏度。利用聚丙烯醯胺凝膠製造該膜。其設計使得聚丙烯醯胺凝膠的孔徑足夠小，可以選擇性地允許小於 10 kDa 的分析物分子透過。製造過程首先對玻璃基底進行圖案化，以建立微流控通道和腔室。該過程使用常規的光刻和溼法蝕刻完成。在頂部玻璃蓋上鑽孔。然後，將玻璃基底和玻璃蓋透過陽極鍵合粘合在一起。建立微流控結構後，將脫氣 22%（15.7:1）丙烯醯胺/雙丙烯醯胺（6% 雙丙烯醯胺交聯劑）和 0.2%（w/v）VA-086 的溶液引入通道，如圖所示。可以使用注射器將溶液載入到通道中。凝膠前體溶液靜置約 30 分鐘以平衡。

尺寸排阻膜採用雷射光聚合製造。使用 355 奈米紫外雷射片材在指定位置（如圖所示）對聚丙烯醯胺凝膠進行圖案化，以建立膜輪廓。將聚丙烯醯胺凝膠膜暴露在雷射中直到聚合，大約需要 15 秒。將剩餘的凝膠溶液抽走，然後用緩衝液沖洗通道進行清洗。


步驟 2：製造分離通道[3]

步驟 2：製造分離通道

材料:

  1. 脫氣 8%（37.5:1）丙烯醯胺/雙丙烯醯胺（2.6% 雙丙烯醯胺交聯劑）
  2. 0.2%（w/v）VA-086[9]（光引發劑）
  3. 1X Tris/甘氨酸緩衝液

製造尺寸排阻膜後，下一步是構建分離通道。該分離通道是蛋白質分離發生的地方。它包含一種中等孔徑的聚丙烯醯胺凝膠。與膜一樣，分離凝膠透過光聚合製造。為了製造分離通道，將分離凝膠前體溶液小心地用注射器載入到微流控通道中。凝膠溶液由脫氣 8%（37.5:1）丙烯醯胺/雙丙烯醯胺（2.6% 雙丙烯醯胺交聯劑）、0.2%（w/v）VA-086 光引發劑和 1X Tris/甘氨酸緩衝液組成。凝膠載入方向由圖中所示的箭頭指示。凝膠載入到指定位置以定義分離通道。

凝膠均勻性是分析重複性的一個非常重要的因素。為了保證均勻性，膜分離側的所有微流控通道必須在聚合前充滿凝膠。因此，建立了一個凝膠塞，以防止在後續凝膠載入過程中凝膠洩漏。如圖所示，凝膠塞透過光聚合製造，使得不需要聚合的區域受到暗場掩模的保護。通常，使用 100 瓦紫外光源進行光聚合過程大約需要 10 分鐘。


File:UCEI Step 3.png
步驟 3：製造載入通道[3]

步驟 3：製造載入通道

材料:

  1. 脫氣 3.5%（37.5:1）丙烯醯胺/雙丙烯醯胺（2.6% 雙丙烯醯胺交聯劑）
  2. 0.2%（w/v）VA-086[9]（光引發劑）
  3. 1X Tris/甘氨酸緩衝液

在這一步中，膜分離側剩餘的微流控通道（沒有凝膠）小心地充滿凝膠前體溶液，如圖中所示的箭頭指示。該溶液包含脫氣 3.5%（37.5:1）丙烯醯胺/雙丙烯醯胺（2.6% 雙丙烯醯胺交聯劑）、0.2%（w/v）VA-086 光引發劑和 1X Tris/甘氨酸緩衝液。該凝膠溶液將生成具有大孔徑的聚丙烯醯胺凝膠，並定義載入通道。

分離通道和載入通道都充滿凝膠後，整個微流控裝置暴露在紫外線下 15 分鐘。結果，分離凝膠和載入凝膠聚合，分別定義了分離通道和載入通道。現在，該微流控裝置可以使用了。


完整的微流控凝膠電泳裝置[3]

完整的微流控裝置

圖示顯示了製造後的完整微流控凝膠電泳裝置。該裝置包含三種不同孔徑的聚丙烯醯胺凝膠。孔徑最大的凝膠用於載入通道，以透過防止整體流動促進樣本和試劑的電泳。孔徑中等大小的凝膠用於分離通道以進行蛋白質分離。最後，孔徑最小的凝膠用作尺寸排阻膜，用於富集過程。有關其功能的詳細說明將在題為工作原理的部分中介紹。

在裝置設計中，所有載入通道都連線到載入區域，載入區域是在開始時（陽極鍵合之前）鑽出的孔。樣品和試劑被裝載到那裡。此外，一些孔被用作廢液收集的儲液器。這些是電流流向的地方。值得注意的是，除了是載入區域外，它們還用作電極的插入點，電極連線到可程式設計供電電壓源。

不使用時，此微流控凝膠電泳裝置必須保持浸沒在緩衝液中並儲存在 4°C。


二、工作原理

基於帶電分子電動力學傳輸的相同原理，微流控凝膠電泳與常規平板凝膠電泳的工作原理類似，但處理速度更快，檢測靈敏度更高，系統高度自動化整合。在本節中，將使用上一節中描述的微流體結構討論微流控凝膠電泳的基本操作。

待討論的微流控凝膠電泳系統由包含微流控通道/儲液器、電源和熒光檢測系統的結構組成。用於運輸分析物的通道和儲液器設計為充滿大孔徑聚丙烯醯胺凝膠。這種大孔徑凝膠透過阻止體積流動來促進分析物的電動力學傳輸。[3] 電源設計為可程式設計。可以立即分配一對電極及其極性。這提供了對微流體環境中才能實現的電動力學過程的更好控制。熒光檢測功能也整合到系統中。它用於檢測目標分析物並量化其濃度。

在本節中，將逐步討論操作步驟，包括每個步驟背後的原理，假設目標分析物帶負電。請注意，討論將主要集中在免疫測定應用上，該應用更普遍地適用於 Herr 等人的研究。[3] 系統可以進行少量修改以用於其他應用。


電動力學載入熒游標記的報告器 [3]

載入已知濃度的報告器

作為免疫測定研究的工具，使用特定於特定目標蛋白質的報告器。抗體可以作為檢測所研究的蛋白質或抗原的報告器，就像對目標蛋白質具有高親和力的受體一樣。為了一般性，在本節中將使用術語“報告器”。

要開始使用該裝置，需要用緩衝液填充微流體通道。然後，將已知濃度的報告器溶液與樣品溶液一起載入到指定的儲液器中。通常對於微流體裝置，每次分析所需的體積約為幾十微升。為了檢測和量化，報告器通常用熒光標籤標記。檢測和量化方法將在後面詳細討論。

載入熒游標記的報告器後，啟用連線到報告器和樣品廢液儲液器的一對電極，如示意圖所示。然後在兩個電極之間施加電勢。當報告器分子在緩衝液中帶電時，它們會以電動力學的方式向樣品廢液儲液器移動，如紅色箭頭所示。但是，報告器分子被尺寸排阻膜阻擋，該膜僅允許尺寸小於 10 kDa 的顆粒透過。在此載入步驟中，只有離子緩衝液可以穿透膜。在第一次電泳結束時，越來越多的熒游標記的報告器分子在凝膠側的膜上聚集，如插圖所示。


電動力學載入樣品 [3]

載入包含目標分析物的樣品

下一個過程是以電動力學的方式載入樣品以與已在膜上聚集的報告器結合。與報告器一樣，分析物分子在緩衝液中帶電。要開始電泳，連線到報告器儲液器的電極被停用。連線到樣品儲液器的電極被開啟。這兩個電極之間的電勢導致樣品中蛋白質的帶電分子以電動力學的方式向樣品廢液儲液器移動，如紅色箭頭所示。

一旦分析物的帶電分子到達膜，一些尺寸小於 10 kDa 的分子會穿過膜並被收集到樣品廢液儲液器中。只有更大的分子，包括目標蛋白質，會留在膜的凝膠側，如插圖所示。此過程有助於提高分析物的濃度，提高報告器與目標蛋白質之間結合的機率。然而，非目標蛋白質也會變得更加集中，並可能導致信噪比水平降低。使用具有高結合特異性的報告器可以緩解此問題。值得注意的是，微流控凝膠電泳免疫測定的靈敏度和動態範圍取決於這種富集過程。

需要精心設計，以便電泳持續足夠長的時間，以便更多的報告器和目標蛋白質結合在一起。通常，所用報告器的濃度遠高於目標蛋白質的濃度。因此，所有目標蛋白質分子更有可能被報告器分子檢測到。在第二次電泳結束時，報告器及其複合物，包括剩餘的非目標蛋白質，會留在膜的凝膠側。


切換電極以避免在電泳分離過程中透過膜執行電流 [3]

避免在分離過程中透過膜執行電流

據報道，當透過膜執行電流時，凝膠電泳分離會出現不可重複的結果。[3] 因此，有必要避免在分離過程中，尤其是在分離過程中，在膜上施加電勢。一種可能的解決方案是程式設計電源，以便在目標分析物進入分離凝膠之前切換電極。該圖顯示了滿足此要求的切換過程。

根據該圖，電勢最初施加在膜上，只是為了將分析物從膜上運輸。在分析物進入分離凝膠之前，左上角緩衝液儲液器的電極被停用。同時，右上角緩衝液儲液器上的一個具有相同極性的新電極被開啟。可以看出，帶負電的分析物的流動保持在相同的路線，朝向緩衝液廢液儲液器移動。

值得注意的是，還有其他電極組合也可以用於執行此步驟。概念是簡單地不允許在分離步驟期間在膜上進行電泳。在第三次電泳結束時，所有帶電分子都已準備好進行凝膠電泳分離。


未結合報告器及其複合物的電泳分離，可透過雷射誘導熒光檢測 [3]

凝膠分離

在此步驟中，報告器分子及其複合物透過凝膠電泳分離。該過程透過電動力學的方式將帶電分子帶入分離凝膠中。由於報告器分子及其複合物具有相似的荷質比，因此這兩種物質之間的分離僅基於其分子量 (MW) 的差異。值得注意的是，所有非目標蛋白質都不會在此免疫測定中進行研究。只有報告器分子及其複合物處於檢查中。

由於報告器分子用熒光染料標記，因此可以使用單點雷射來誘導熒光。這種雷射誘導熒光 (LIF) 由檢測器監測，該檢測器將檢測未結合報告器及其複合物的存在，然後將檢測到的熒光強度與兩種物質的濃度相關聯。該熒光檢測系統放置在分離通道的緩衝液廢液儲液器附近。檢測和量化概念將在下面描述。


熒光檢測、電泳圖和凝膠狀圖 [3]

熒光檢測和結果

單點雷射誘導熒光 (LIF) 是一種用於檢測和量化報告器分子及其複合物的平均方法。當分子穿過雷射束時，附著的染料會發出熒光，其強度由檢測器測量。然後，檢測器生成與測量強度相對應的電泳圖。電泳圖峰下的面積可以與目標蛋白質的濃度相關聯。

未結合的報告器可以透過以下事實與其複合物區分開來：未結合的報告器分子的分子量 (MW) 低於其複合物。因此，未結合的報告器分子在分離凝膠中以電動力學的方式更快地移動，並首先被檢測到。相應的強度在電泳圖中給出第一個峰。

在配體和受體單對的情況下，電泳圖中通常會有兩個峰。通常，第一個峰屬於分子量較小的受體或報告器，其次是對應於分子量較大的配體-受體複合物的第二個峰。此資訊也可以用計算機生成的凝膠狀圖表示。在凝膠狀圖中，最上面的條帶代表首先到達的未結合報告器分子。條帶的亮度傳達有關檢測到的熒光強度程度的資訊。條帶的寬度對應於峰的寬度，它傳達有關分析物遷移時間的資訊。

值得一提的是，受體和配體之間的結合機率是免疫測定靈敏度和準確性的一個重要因素。因此，富集過程在提高這種機率方面起著重要作用。為了增強這種富集過程，已經證明對樣品進行預處理（片外）或增加電泳樣品載入時間段是有效的。


三、臨床應用

一項臨床應用報道了這種微流控凝膠電泳裝置在輔助口腔診斷中的應用。[1][3] 它被用於牙周病的早期診斷，以及監測疾病狀態及其從人唾液中的發展。牙周病或牙周炎是一種推定的口腔疾病，它會破壞膠原蛋白，導致主要組織損傷、結締組織附著喪失和骨質流失。在牙周炎患者唾液中發現基質金屬蛋白酶-8 (MMP-8)、白介素-1β (IL-1B) 和 C 端端肽吡啶啉交聯 (ICTP)。這些蛋白質被鑑定為疾病生物標誌物，併成為檢測和監測這種口腔疾病的目標蛋白質。[1] Herr 等人展示了使用這種微流控凝膠電泳裝置檢測和定量 MMP-8。

在他們的研究中，針對 MMP-8 的單克隆抗體被用作報告分子，它具有僅與唾液中的 MMP-8 結合的特異性。使用這種單克隆抗體 (MMP-8) 具有一個優勢，即它消除了對匹配對抗原抗體的需求。在報告分子混合物中，還添加了牛血清白蛋白 (BSA) 蛋白標準作為參考。兩者 (MMP-8* 和 BSA*) 為了檢測目的而被熒游標記。請注意，星號用於表示熒游標記的分析物。根據他們的研究，混合物中使用了 1 nM 的 (MMP-8*) 和 1 nM 的 BSA*。

在微流控裝置中，(MMP-8*) 僅與 MMP-8 生物標誌物結合，形成一個具有相似電荷質量比的複合物。未結合的抗體及其複合物根據其大小的差異透過分離凝膠相互分離，並如微流控凝膠電泳的工作原理所述，分別檢測到。在這種免疫測定應用中，具有最高遷移率的 BSA* 首先被檢測到，其次是剩餘的 (MMP-8*) 和 MMP-8 複合物。相應的峰值顯示在電泳圖和凝膠狀圖中。使用凝膠狀圖中的峰面積或譜頻寬度來計算 MMP-8 的濃度。

為了能夠量化從患者收集的唾液樣本中內源性 MMP-8 的濃度，首先需要生成校準曲線。校準曲線是從已知 MMP-8 濃度的分析中獲得的。透過在健康患者的稀釋唾液中新增已知濃度的重組 MMP-8，然後進行微流控凝膠電泳，進行了一系列實驗。從電泳圖中，將 MMP-8 複合物的峰面積與 BSA* 的峰面積進行歸一化，然後繪製成對應濃度的函式。使用四引數邏輯模型[3] 的非線性最小二乘擬合方法用於獲得校準曲線。基於此校準曲線，根據其歸一化峰面積預測內源性 MMP-8 複合物的濃度。據報道，健康受試者和患病受試者中 MMP-8 的平均濃度分別為 64.6 +/- 16.4 ng/mL 和 623.8 +/- 204.0 ng/mL。[3] 值得注意的是，被歸類為牙周病的患者中 MMP-8 的濃度反映了該疾病的動態活性。

透過與從常規酶聯免疫吸附測定 (ELISA) 獲得的結果進行比較，驗證了從微流控凝膠電泳獲得的結果的有效性。正如 Herr 等人報道的那樣，從微流控裝置獲得的結果與來自 ELISA 的結果高度相關，r2 = 0.979，其中 r 是皮爾遜積矩相關係數。然而，這種基於微流控的免疫測定與常規對應物相比具有幾個優勢，因為它繞過了 ELISA 所需的耗時反應和洗滌步驟，更加自動化，僅需要單一抗體，使其適用於更廣泛的應用，並且每次分析所需的唾液樣本量更少。此外，它不需要抗體的表面固定。

除了測量牙周炎患者 MMP-8 的濃度外，還進行了臨床檢查，以將分析資料與生理症狀相關聯。發現 MMP-8 與骨骼和組織丟失高度相關，但與探查時出血無關。透過對 MMP-8 生物標誌物的高度靈敏檢測，這種基於微流控的免疫測定可以提供早期診斷，從而改善該疾病的臨床治療。此外，使用 MMP-8 抑制劑來減少膠原蛋白降解，這種微流控凝膠電泳裝置可以用於監測和跟蹤 MMP-8 抑制劑治療的進展。


微流控毛細管電泳

在本節中，將介紹另一種型別的微流控電泳。與微流控凝膠電泳不同，微流控毛細管電泳基於本體流的電動現象原理。分析物的電荷質量比的差異是毛細管微流控通道中電泳分離的根本原因。由於不需要篩分介質，微流控毛細管電泳在製造和可重複使用方面比其凝膠對應物更有利。本文將詳細描述該裝置的詳細製造過程和工作原理，包括其臨床應用。請注意，以下解釋的製造過程和工作原理基於 Backofen 等人 2002 年發表的論文。[10]


一、製造工藝

使用 PDMS 製造微流控結構比使用玻璃更容易且成本更低。該過程從建立用於模製 PDMS 的模具開始，可以透過對光刻膠進行圖案化來獲得。顯影后，將 PDMS 和交聯劑的混合物倒在圖案化的光刻膠上，然後固化。將 PDMS 剝離並切割，以建立通往儲液器的通道。最後，將這種圖案化的 PDMS 永久地附著在玻璃基座上，即可使用。以下是分步詳細過程。


描述使用負性光刻膠和標準光刻技術建立用於 PDMS 模製的模具的示意圖[10]

建立用於 PDMS 模製的模具

材料：[10]

  1. 光掩膜
  2. 4 英寸矽片
  3. SU-8 50 負性光刻膠
  4. 丙二醇甲醚醋酸酯顯影劑

首先從準備過程開始，建立光掩膜。使用的光掩膜通常是接觸式光掩膜，可以由玻璃製成，或者簡單地是印刷了設計的微流控結構佈局的透明材料。光掩膜用於將這種微流控圖案轉移到光刻膠上，光刻膠被旋塗到矽片上。值得注意的是，使用的光刻膠的選擇會影響光掩膜的設計。例如，如果使用負性光刻膠，則所有微流控圖案都需要使用明場進行設計，以便紫外線能夠透過並聚合負性光刻膠的接觸區域。未曝光區域將在顯影劑中被洗掉。另一方面，設計圖案是正性光刻膠的光掩膜的暗場。

在塗覆光刻膠之前，需要先清潔矽片。標準 RCA 清洗過程適用。然後，將負性光刻膠旋塗到矽片上並進行預烘烤。在紫外線照射下，塗覆的負性光刻膠根據光掩膜上設計的微流控佈局進行圖案化。然後對曝光的光刻膠進行後烘烤和顯影。結果，如圖所示，只有負性光刻膠的曝光區域保留了下來。[10]


顯示使用顯影的圖案化光刻膠進行 PDMS 模製的示意圖[10]

模製 PDMS 以製造微流控結構

材料：[10]

  1. PDMS 低聚物
  2. Sylgard 184 交聯劑

準備用於 PDMS 模製的模具後，準備 PDMS 和交聯劑的混合物。聚合物和交聯劑的比例為 10:1。[10] 然後將脫氣的混合物倒在晶片上，以覆蓋整個光刻膠模具。最後，將模製的 PDMS 在 70 °C 的烘箱中固化 1 小時。[10] 該步驟總結在示意圖中。此外，還提供了在晶片上模製的 PDMS 的橫截面圖。

固化後，將 PDMS 從晶片上剝離。將具有轉移的微流控結構的 PDMS 進一步處理，為每個圓形儲液器區域建立開口。這個開口將用於載入樣品或試劑，以及施加真空和壓力的地方，真空和壓力由注射器調節。


顯示完整的微流控毛細管電泳裝置的示意圖[10]

完成微流控毛細管電泳裝置

材料:

  1. 玻璃板
  2. 針式探頭

一塊帶有塗層圖案電極的玻璃板用於封閉微流體通道和儲液池，同時為儲液池中的流體提供電氣連線。 電極可以透過鉻和鉑的蒸發在玻璃基板上製造。 鉻用作玻璃基板和鉑電極之間的粘合層。 金屬圖案可以透過常規光刻工藝實現，該工藝需要另一個光掩模（透明體）來在玻璃上形成電極。 值得注意的是，最終的微流體毛細管電泳系統中使用了圖案電極和針探針的組合，如示意圖所示。 鉑針探針用於為電泳提供高電勢，同時用作電化學感測器。

PDMS 透過等離子體氧化永久附著在玻璃板上。 氧原子和矽原子之間的共價鍵 (O-Si-O) 在兩種材料之間提供永久密封。 完成的微流體毛細管電泳裝置如示意圖所示。


二、工作原理

一般來說，微流體毛細管電泳裝置的操作可以透過三個基本步驟來描述——載入樣品/試劑、形成樣品塞和電泳分離。 此處描述的載入過程涉及使用注射器手動載入以調節流速。 載入完所有樣品和試劑後，形成樣品塞。 此步驟需要仔細設計，因為分析物的濃度依賴於此步驟。 在最後一步中，分析物透過電泳分離。 與（微流體）凝膠電泳中的尺寸分離不同，（微流體）毛細管電泳的分離是基於分析物電荷與質量比的差異。

值得注意的是，這裡討論的微流體毛細管電泳系統用作分析平臺，所有樣品預處理步驟都在晶片外進行。 以下描述主要集中於樣品中帶負電荷分析物的分析。 請注意，以下描述的操作原理部分基於 Backofen 等人 2002 年發表的文章。[10]


所有微流體通道均透過手動填充並透過電泳平衡[10]

載入過程

系統設定從用緩衝液和預處理的樣品溶液載入微流體儲液池開始，這樣除了樣品儲液池之外的所有儲液池都包含緩衝液。 繼續用緩衝液填充微流體通道，將注射器連線到儲液池的頂部開口，並用於調節流速。 應用真空和壓力直到通道充滿緩衝液。

下一個過程是透過電泳平衡樣品和緩衝液。 為此，將高壓電源連線到系統，如示意圖所示。 一種可能的配置是使用多個電源裝置，例如兩個 U1 = 0.5 kV 裝置和一個 U2 = 1.2 kV 裝置。 此過程允許緩衝液和樣品在通道中定位，如示意圖所示。


樣品溶液流過小的連線通道並進入通向緩衝液和緩衝液廢液儲液池的通道[10]

形成樣品塞

為了分析樣品，需要將樣品的預定義和可控部分注入分離通道。 樣品的這種預定義和可控部分稱為樣品塞。 根據所討論的微流體結構，樣品塞是由樣品溶液的流體動力學流動形成的，這是由於儲液池中溶液液位的差異造成的。 這種流體動力學流動僅在所有高壓電源關閉時才會發生。

如示意圖所示，部分樣品溶液流過小的連線通道，進入通向緩衝液和緩衝液廢液儲液池的通道。 此部分樣品可以分成兩個埠，分別用藍色和黃色虛線輪廓表示，如插圖所示。 藍色輪廓是樣品塞，其體積可以透過設計指定。 黃色虛線輪廓表示當重新開啟高壓電源時會流回樣品廢液儲液池的部分樣品。


樣品塞沿分離通道電動力學地移動到緩衝液廢液儲液池[10]

電泳分離

當開啟所有高壓電源時，帶負電荷的分析物分子和緩衝液離子開始透過電泳再次流動。 在小的連線通道處，部分樣品溶液開始分成兩部分，然後向相反方向移動。 如插圖所示，用藍色虛線輪廓表示的部分樣品溶液，即樣品塞，沿分離通道電動力學地移動到緩衝液廢液儲液池。 另一方面，用黃色虛線輪廓表示的部分樣品溶液透過電動力學地移動到樣品廢液儲液池。 然後，小的連線通道會像最初那樣被緩衝液填充。

在分離通道中，樣品塞中的帶負電荷的分析物由於它們的電荷與質量比的差異而被分離。 每個分析物都由放置在末端緩衝液廢液儲液池的電化學感測器檢測。 對於此微流體毛細管電泳系統中使用的電化學感測器，每個分析物的檢測是基於針探針和參比電極之間的電壓降的降低。 這些電壓降可以在電泳圖中繪製，並可用於研究樣品溶液中的分析物成分，例如蛋白質或肽。


三、臨床應用

Guzman 等人 2008 年報道的皮膚病變患者生物標誌物的檢測和定量[5] 是微流體毛細管電泳的臨床應用之一。 基於前面描述的相同基本原理，他們的研究中使用了更復雜設計的微流體毛細管電泳，稱為免疫親和毛細管電泳 (IACE)。 IACE 是一種晶片實驗室，它利用微流體技術在一個晶片上整合了基於親和性的純化、富集和電泳分離過程。

在針對這種炎症性疾病的生物標誌物的臨床研究中，IACE 用於分析來自不同皮膚損傷階段患者的微解剖樣本。 十二種不同的抗體用於捕獲被認為是生物標誌物的十二種相應的靶蛋白/肽。 這種親和力結合也有助於從微流體環境中分離靶分析物和非靶分析物，從而改善後續的富集過程並減少分析過程中的背景噪聲。 據報道，整合的富集功能提高了靈敏度並增強了 IACE 的低檢測限。 可以檢測和定量的濃度低至每毫升幾納克。 據報道，憑藉這種高度靈敏的能力，IACE 可用於監測疾病的進展模式。 IACE 獲得的結果被證明與傳統的組織病理學等金標準一致。


註釋

  1. ↑ a b c d e f Herr AE，Hatch AV，Giannobile WV，Throckmorton DJ，Tran HM，Brennan JS，Singh AK。"用於口腔診斷的整合微流體平臺" Ann NY Acad Sci. 作者手稿可在 PMC 中獲得 (2008)。
  2. ↑ Xu X，Li L，Weber SG。"用於毛細管和晶片分離的電化學和光學檢測器" 趨勢分析化學。 作者手稿可在 PMC 中獲得 (2008)。
  3. ↑ a b c d e f g h i j k l m n o p q r s t u Herr AE，Hatch AV，Throckmorton DJ，Tran HM，Brennan JS，Giannobile WV，Singh AK。"微流體免疫分析作為基於唾液的快速臨床診斷" 美國國家科學院院刊。 104(13):5268-5273 (2007)。
  4. ↑ Barry R，Ivanov D。"生物技術中的微流體" 奈米生物技術雜誌 2:2 (2004)。
  5. ↑ a b c d Guzman NA，Blanc T，Phillips TM。"免疫親和毛細管電泳作為一種強大的策略，用於生物基質中低丰度生物標誌物、藥物和代謝物的定量" 電泳。 作者手稿可在 PMC 中獲得 (2009)。
  6. ↑ Gong M，Wehmeyer KR，Limbach PA，Arias F，Heineman WR。"使用微晶片毛細管電泳中的場增強堆積注射線上樣品預濃縮" 分析化學。 作者手稿可在 PMC 中獲得 (2008)。
  7. ↑ Gong M，Wehmeyer KR，Stalcup AM，Limbach PA，Heineman WR。"簡單流體動力學注射中微晶片毛細管電泳注射偏差研究" 電泳。 作者手稿可在 PMC 中獲得 (2008)。
  8. ↑ Hsieh J-F，Chen S-T。"基於凝膠的微晶片和 SDS-PAGE 分析糖蛋白和脂多糖的比較研究" 生物微流體學 1 (2007)。
  9. ↑ a b c 和光純藥工業株式會社 ( http://www.wakousa.com/specialty/specialty_focus.html )
  10. ↑ a b c d e f g h i j k l Backofen U, Matysik F-M, Lunte CE. "A chip-based electrophoresis system with electrochemical detection and hydrodynamic injection" Anal Chem. 作者手稿 可在 PMC 獲取 (2008).

參考文獻

摘自 "https://wikibook.tw/wiki/Proteomics/Protein_Separations-_Electrophoresis/Introduction_to_Electrophoresis"
華夏公益教科書