蛋白質組學/蛋白質分離- 電泳/凝膠電泳
凝膠電泳 (GE) 用於根據其物理特性區分分子實體。這些決定性特徵包括尺寸、形狀、電荷和等電點。等電點可能是最重要的特徵；它是分析物上的總電場力為 0 的點，因此也是分析物在凝膠中停止遷移的點。凝膠電泳用作分析技術或作為製備技術，用於在用於其他方法（如質譜法）之前純化分子，質譜法基於以下原理：當帶電分子置於電場中時，它們會根據其電荷遷移到正極或負極。由於核酸由於其磷酸基團而帶負電，因此它們會遷移到陽極。與核酸不同，蛋白質可以具有淨正電荷或淨負電荷，因此它們可以遷移到任一極，具體取決於電荷。
蛋白質的形狀和電荷對凝膠電泳過程中的蛋白質遷移行為有很大影響，尤其是在電泳之前沒有使蛋白質變性時。聚丙烯醯胺凝膠電泳 (PAGE) 通常用於分離蛋白質。PAGE 可用於在其他蛋白質組學技術之前純化蛋白質或分析蛋白質的質量、電荷和/或存在的資訊。由於這些複雜的結構，蛋白質通常在存在如十二烷基硫酸鈉 (SDS) 等去汙劑的情況下變性或分解為簡單的初級結構，SDS 會使蛋白質帶負電，從而允許適當的遷移。SDS 的結合量與蛋白質的大小成正比，因此該方法主要根據分子量分離蛋白質。二維 PAGE (2-D PAGE) 在第一個維度中透過等電點區分蛋白質，在第二個維度中透過分子量區分蛋白質。天然 PAGE 在不使蛋白質變性的情況下根據質量/電荷比分離蛋白質。
電泳通常在由瓊脂糖或聚丙烯醯胺製成的基質或凝膠中進行。這些凝膠是化學惰性的，因此它們對分析物的干擾很小。瓊脂糖是一種多糖，是從海藻中提取的。在任何特定凝膠中使用的瓊脂糖濃度可能會有所不同。通常，凝膠中瓊脂糖的濃度越高，孔徑就越小。
為了分離蛋白質，使用聚丙烯醯胺（丙烯醯胺的交聯聚合物）。為了避免氧氣抑制聚合，將液體聚丙烯醯胺倒入玻璃板之間以製成凝膠板。聚丙烯醯胺的低濃度或其組成分子丙烯醯胺之間的交聯較少會導致孔徑較大的凝膠。標準蛋白質凝膠通常由兩層組成，最上面一層稱為堆疊凝膠，下面一層稱為分離凝膠或分離凝膠。堆疊層含有低百分比的丙烯醯胺和低 pH 值。分離凝膠的丙烯醯胺濃度根據待執行的樣品而異，其 pH 值高於堆疊凝膠。堆疊凝膠和分離凝膠之間 pH 值和丙烯醯胺濃度的差異可以提高解析度並在分離凝膠中形成更清晰的條帶。與瓊脂糖凝膠相比，聚丙烯醯胺凝膠具有更高的分離能力。[1]
由於其不那麼多孔的性質，丙烯醯胺凝膠經常用於分離 DNA、RNA、寡核苷酸和其他較小的分子。使用不同濃度的丙烯醯胺可以提供更厚或更薄的基質。與任何凝膠一樣，凝膠的濃度或其成分的獨特特徵可能會影響分析物的遷移。
凝膠包含用於放置樣品的孔，分析物從這些點開始遷移。一旦施加電流，分子標記將在凝膠的一側或兩側執行以供以後比較，因為它將與樣品一起遷移透過凝膠。覆蓋凝膠的電泳緩衝液提供均勻的 pH 值並提供離子以支援電導率。當在凝膠上施加電流時，樣品分子開始以不同的速率透過凝膠基質遷移，如果帶正電則遷移到陰極，如果帶負電則遷移到陽極。電壓以及分配給特定執行的時間取決於凝膠的大小和待分析的樣品型別。長時間執行電流可能會導致樣品遷移出凝膠，而將電壓調得過高可能會損壞樣品或燒燬凝膠本身。[2]
分析物片段很少能用肉眼在凝膠中看到，因此必須對凝膠進行染色才能進行分析。分析物片段作為凝膠中的實心帶解析。可以使用多種染料來觀察帶，包括溴化乙錠、銀或考馬斯亮藍，具體取決於樣品。可能使用的不太常見的染料包括熒光染料、鋅和銅。染色時間可能從幾個小時到幾天不等，具體取決於凝膠型別和分析物型別。染料的解析度也會有所不同。
染色完成後，可以用肉眼觀察視覺化。然而，使用紫外 (UV) 光通常更容易進行視覺化。但是，此方法僅在所考慮的分子在 UV 光下發出熒光時才有效。[3]或者，如果樣品分子包含放射性原子，則可以記錄凝膠的放射自顯影圖。
帶的分析包括將樣品生成的帶與已知蛋白質生成的帶進行比較，無論是對照樣品還是分子標記（標準）。可以透過去除包含感興趣條帶的凝膠的一部分來進行進一步的分析。凝膠內消化可以從較小的凝膠塊中去除蛋白質，並允許直接操作分析物。凝膠分析通常很費時，而且很難獲得清晰的條帶，因為樣品很少是純淨的。
維基百科還包含對凝膠電泳的相當詳細的描述；有關更多資訊，請點選這裡.
- ^ “凝膠電泳原理。” http://www.vivo.colostate.edu/hbooks/genetics/biotech/gels/principles.html
- ^ Hames, B. D. 和 D. Rickwood。蛋白質凝膠電泳：實用方法。牛津大學出版社，1998 年。
- ^ “生物動畫庫。” http://www.dnalc.org/ddnalc/resources/electrophoresis.html