蛋白質組學/蛋白質分離- 電泳/一維凝膠電泳
十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳 (SDS-PAGE) 是一種非常常見的凝膠電泳方法，用於根據質量分離蛋白質。 SDS-PAGE 最初被稱為 Laemmli 方法，以其發明者 U.K. Laemmli 的名字命名。該技術的主要部分發生在蛋白質進行電泳之前；它們在稱為十二烷基硫酸鈉 (SDS) 的去汙劑中變性。SDS 透過與蛋白質的疏水核心結合使蛋白質變性，並賦予每種蛋白質與其質量成比例的負電荷。SDS 以約 1.4 克 SDS 每 1.0 克蛋白質的比例與蛋白質結合，但可能在 1.1-2.2 克 SDS 每克蛋白質之間變化 [1]。蛋白質可以進一步用還原劑處理，例如二硫蘇糖醇 (DTT)，以破壞任何重新形成的二硫鍵，然後用碘乙醯胺烷基化以防止二硫鍵進一步重新形成。
該過程的最終結果是變性的蛋白質變得線性，因此所有蛋白質具有相似的結構，並且可以根據其分子量進行分離。與傳統的凝膠電泳不同，傳統的凝膠電泳需要將蛋白質分解成線性片段才能進行分析，SDS-PAGE 允許對整個蛋白質進行分析。
有關凝膠、染色和電泳分析的更多詳細資訊，請參閱本章的“凝膠電泳”部分。
在等電聚焦 (IEF) 中，蛋白質透過穿過包含 pH 梯度的凝膠的電流進行分離。蛋白質的電荷取決於其氨基酸側鏈的電荷。這些電荷隨 pH 值而變化。蛋白質將透過 pH 梯度移動，直到其電荷為零，因為中性分子不會被陰極或陽極吸引。蛋白質呈中性的 pH 值稱為等電點。
固定 pH 梯度 (IPG) 用於 IEF，因為固定 pH 梯度即使在非常高的電壓下也能長時間保持穩定。緩衝化合物用於建立 IPG 的 pH 梯度。IPG 是具有塑膠背襯片的鑄造凝膠條，並在不同的 pH 範圍和長度上可商購。它們提供高解析度、高重複性和允許高蛋白負荷。 [2] 等電聚焦在用於提取或溶解蛋白質的相同溶液中進行。
載入有蛋白質的 IPG 條必須在再水化/樣品緩衝液中再水化。再水化可以是主動的或被動的。為了載入更大的蛋白質，施加了一個小電壓，導致主動再水化。電泳完成後，聚焦條可以冷凍儲存。
天然 PAGE 用於根據蛋白質的電荷密度差異分離蛋白質的天然狀態。蛋白質的天然狀態是其正確摺疊的狀態，而不是變性或展開的。在天然 PAGE 中，重要的是凝膠或緩衝液中不存在變性劑。否則，蛋白質將無法保持其天然狀態。許多蛋白質在透過天然 PAGE 分離後被證明具有酶活性。因此，它用於製備純化和活性蛋白質。天然 PAGE 可以在接近中性 pH 的條件下進行，以防止酸和鹼的變性；它有助於研究單個構象以及聚集或自締合。透過保持裝置和樣品冷藏，可以進一步減少變性和蛋白水解。 [3]
蛋白質的遷移率取決於其電荷和大小。任何特定蛋白質的氨基酸組成和翻譯後修飾決定了其電荷。較小的蛋白質或電荷較高的蛋白質在電泳過程中比較大的蛋白質或電荷較低的蛋白質移動得更遠。
維基百科在其資料庫中為 SDS-PAGE、IEF 和 Native-PAGE 設定了頁面。下面列出了所有這三者的連結
- ^ Mullins, Dyche。 “SDS PAGE 凝膠到底是如何工作的？” http://mullinslab.ucsf.edu/protocols/html/SDS_PAGE_protocol.htm
- ^ “等電聚焦。”（康奈爾大學）http://instruct1.cit.cornell.edu/Courses/biobm330/protlab/IEF.html
- ^ “等電聚焦。” http://www.sigmaaldrich.com/Area_of_Interest/Life_Science/Proteomics_and_Protein_Expr_/Protein_Analysis/Protein_Electrophoresis/Isoelectric_Focusing.html
- ^ “天然凝膠。” http://www.ap-lab.com/native_gels.htm