蛋白質組學/蛋白質分離- 電泳/差異凝膠電泳 (DIGE)
差異凝膠電泳 (DIGE) 是一種用於監測不同功能狀態下細胞間蛋白質組譜差異的技術。這分三步進行。首先，樣本用獨特的熒光染料標記。其次，它們在同一個 2D-PAGE 凝膠上一起執行。最後，執行完成後，同一個凝膠的不同熒光影像相互疊加。DIGE 允許研究差異表達的蛋白質，以及樣本之間共同存在的蛋白質。該技術允許在一個凝膠上同時分離和比較最多三個樣本。[1]
在傳統的 2D-PAGE 中，不同的樣本通常在多個凝膠中分離。然後將這些凝膠疊加以比較一個凝膠與另一個凝膠。由於凝膠之間在空間解析度和斑點強度方面的差異，影像的疊加和蛋白質的正確匹配很困難。等電聚焦條帶的蛋白質吸收量可能存在差異，蛋白質從第一維凝膠到第二維凝膠的轉移可能不完整，凝膠成分、場強或 pH 梯度可能存在區域性不一致。這些凝膠間差異可能會掩蓋樣本之間的生物學差異。不幸的是，並非所有這些變化都是可以避免的；它們可能由於多種原因而發生。因此，使用 2D-PAGE 難以對蛋白質表達水平進行定量比較。
在 DIGE 中，蛋白質混合物在電泳前預先用花青染料標記，以確保蛋白質的共遷移。這種在同一個凝膠上的共遷移消除了樣本之間的執行差異。此外，樣本在整個實驗過程中都處於相同的環境和相同的程式中。以這種方式將實驗變異降至最低。在 DIGE 中，無需在電泳後處理凝膠進行視覺化。
用於 DIGE 的花青染料（Cy2、Cy3 和 Cy5）是 N-羥基琥珀醯亞胺酯衍生物，共價標記蛋白質的賴氨酸殘基的 ε-氨基，並將 ε-氨基的正電荷替換為染料的正電荷。染料的結合為蛋白質引入了小的但匹配的分子量增加。由於這些染料是疏水的，為了防止蛋白質沉澱，每個蛋白質只標記一個賴氨酸殘基（最小標記）。最小標記限制了熒光強度，從而限制了染料的靈敏度。所有染料在電荷和分子量上都匹配，以防止等電點的改變，並將電泳過程中染料誘導的標記蛋白質的位移降至最低。[2]
還存在另一類花青染料，稱為飽和染料，它們飽和半胱氨酸殘基，而不是最小標記賴氨酸殘基。同樣，這些染料在質量和電荷上是匹配的；但蛋白質修飾和等電點偏移的可能性較小。飽和半胱氨酸染料對最小賴氨酸標記具有更高的靈敏度。與最小賴氨酸標記花青染料一樣，如果蛋白質中不存在半胱氨酸氨基酸，則飽和染料將無法對其進行標記，導致蛋白質無法檢測。
首先用丙基-Cy3 和甲基-Cy5 標記兩種蛋白質樣本。標記樣本後，將其應用於單個 2D-GE 凝膠。執行完成後，透過依次用每種染料的激發波長照射凝膠來視覺化相應的蛋白質斑點。使用成像軟體分析得到的蛋白質斑點。然後從凝膠中切下差異表達的蛋白質斑點，並透過質譜法鑑定。
為了研究多個樣本，需要大量成對比較或分析在不同凝膠上執行的樣本。一個重要的替代方法是使用第三種染料 (Cy2)，其特性與 Cy3 和 Cy5 相似。用 Cy3 或 Cy5 標記蛋白質樣本，並將包含實驗中所有樣本等量混合的樣本用 Cy2 標記。然後將所有樣本應用於同一個凝膠。混合樣本作為每個凝膠上每個蛋白質斑點的內部標準，然後用於對所有凝膠上的所有斑點進行歸一化。這種方法減少了實驗變異，提高了定量的準確性和蛋白質表達差異的統計置信度。[3]
為了研究蛋白質的差異表達，無需執行多個凝膠。由於不需要進行電泳後處理（固定或脫色），即使在低分子量範圍內，蛋白質的損失也會減少。這種方法比標準比色染色方法更定量，無論是在靈敏度方面還是線上性方面。
- ^ Mustafa Ünlü, Mary E. Morgan 和 Dr. Jonathan S. Minden。“差異凝膠電泳：檢測蛋白質提取物變化的單一方法。” 電泳 (1997)，18：2071-2077。
- ^ Gert Van den Bergh，Lutgarde Arckens。“熒光二維差異凝膠電泳揭示了基於凝膠的蛋白質組學的潛力。” 生物技術現狀 (2003) 15：38-43。
- ^ Attard，B. 等。“二維差異凝膠電泳 (DIGE)：一種用於高通量蛋白質組學的新方法。http://www.asbmb.org.au/magazine-sample/2004-August_%20Issue35-2/Technical%20Feature%202%20-%20Attard.pdf