蛋白質組學/蛋白質分離 - 色譜法/反相
章節作者：Laura Grell 和 Alexander Butarbutar
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章節修改人：Kai Burnett 和 Dalia Ghoneim
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反相色譜法是一種基於蛋白質溶解度的分離方法。術語“反相”源於其前身“正相”色譜法，後者使用極性固定相，例如二氧化矽。在反相色譜法中，固定相填充了用含有非極性烷基（通常為 C8 或 C18）的矽醚改性的二氧化矽。這創造了一個疏水固定相。另一方面，流動相含有相對極性的有機溶劑，例如甲醇、丁醇、異丙醇、乙腈(Ref1)。
使用這些極性溶劑會給蛋白質帶來非常苛刻的條件，因此該方法通常適用於更小、更穩定的蛋白質。所有肽和蛋白質都攜帶親水性和疏水性氨基酸的混合物，但那些具有高淨疏水性的蛋白質將能夠與固定相進行疏水性相互作用。當蛋白質混合物應用於色譜柱時，極性蛋白質將首先洗脫，而非極性蛋白質將結合到色譜柱上。可以透過增加有機溶劑的濃度來洗脫結合的疏水蛋白，這會增加特定組分的保留時間。反相色譜法通常與質譜法結合使用，以量化從色譜柱洗脫的蛋白質(Res1)。
反相色譜法的步驟與離子交換色譜法中的步驟非常相似。同樣，該過程可以概括為四個步驟(Res2)
- 平衡
- 樣品應用
- 洗脫
- 再生
在此步驟中，疏水色譜柱透過應用特定的樣品緩衝液進行預處理。由於色譜柱是疏水的，水分子往往在色譜柱和緩衝液之間的連線處排列整齊。
在此步驟中，將樣品蛋白質注入系統。混合物中具有高百分比暴露疏水性氨基酸殘基的蛋白質將吸附到疏水性固定相上。混合物中的其他蛋白質將被洗掉。
該過程的這一階段涉及改變緩衝液條件以洗脫結合的疏水蛋白。最常用的方法是使用梯度，該梯度使用有機緩衝液逐漸增加疏水性。蛋白質解吸的順序通常與其每個蛋白質具有的外部疏水殘基數量相關（Res 3）。
此階段涉及從固定相上洗掉任何殘留的蛋白質，並將條件恢復到過程開始時的狀態。這涉及創造一個不太疏水的環境。
這是一個 80 分鐘反相分離執行的樣品圖，達到 70% 有機溶劑水平，具有三個洗脫峰。
請注意此圖中的梯度延遲。延遲是所有液相色譜梯度的常見現象，它是由軟體指示梯度開始泵送以及溶劑到達色譜柱的延遲造成的。還要注意有機溶劑濃度並非從 0% 開始。這是因為結合的碳氫化合物在沒有少量有機溶劑的情況下，在結合其他疏水分子方面效率要低得多。
最佳化
為了看到更大的峰分離，您可以再次執行相同的蛋白質更短的時間，或者降低有機溶劑的最大量。使用上面的圖，似乎最後一個蛋白質在約 50% 的有機溶劑濃度下洗脫。考慮到延遲，最後一個峰洗脫，並且調整了 40% 的有機溶劑濃度。然後可以進行新的分離，使用 40% 的最大有機溶劑濃度，這將產生更多分離的峰。
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