放射腫瘤學/放射生物學/DNA損傷

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輻射誘導的 DNA 損傷

DNA 作為輻射靶標

多條證據表明 DNA 損傷是細胞死亡的關鍵因素
- 微輻射研究表明，如果只照射細胞質，殺死一個細胞需要更高的劑量，而如果照射細胞核則需要更高的劑量
- 短程發射同位素（例如 I-125）在直接摻入 DNA 時會產生有效的殺傷效果
- 單鏈 DNA 斷裂的發生率不會導致細胞死亡，而雙鏈斷裂和染色體畸變的發生率與細胞死亡密切相關
- 胸腺嘧啶類似物（IUdR、BrUdR）摻入染色質後會改變放射敏感性
然而，有一些證據表明輻射對細胞膜的損傷也可能很重要，可能引發細胞凋亡
最後，也有一些證據表明存在“旁觀者效應”，即對於每一個被 RT 微靶向的受損細胞，周圍 80-100 個細胞也會死亡或顯示出受損跡象

DNA 結構

鹼基：氮、氧和碳的環。腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶。透過氫鍵與對面的 DNA 鏈結合
核苷：鹼基 + 脫氧核糖
核苷酸：鹼基 + 脫氧核糖 + 磷酸基團
主鏈：交替的糖（脫氧核糖）和磷酸基團
單鏈：核苷酸序列
雙鏈：透過氫鍵結合在一起的兩條互補鏈
染色體：一條單個 dsDNA 的整個長度；一個細胞中存在多條染色體。由著絲粒和兩條臂組成，但在正常情況下，它們並不像這樣可見
染色質：dsDNA 和蛋白質的複合物，半緊密包裝，在間期存在於細胞核中。每條染色體以染色質形式存在，便於包裝，並便於 DNA 轉錄和修復的訪問
染色單體：在細胞分裂過程中合成後，構成染色體的兩個相同 DNA 複製之一。緊密包裝。只要染色單體透過著絲粒保持接觸，就使用該術語。此後，它們被稱為子染色體

DNA 損傷概述

輻射可能損傷 DNA 的任何組成部分
- 鹼基損傷
- 單鏈斷裂 (SSB)
- 雙鏈斷裂 (DSB)
- DNA 鏈交聯
- DNA-蛋白質交聯
紫外線輻射 (UV-A) 通常會導致鹼基損傷，如 8-oxo-G 和嘧啶二聚體（例如環丁烷嘧啶二聚體和 6-4 光產物），儘管也會導致 SSB。事實上，在用 X 射線照射後通常不會發現嘧啶二聚體
對於治療性輻射，DNA 的損傷是由帶電粒子（X 射線的電子，質子，中子的α粒子）軌跡上的能量沉積引起的
- 能量不是在軌跡上均勻沉積的，沉積模式可以歸類如下
- "刺"：直徑約 4 nm（DNA 直徑的 2 倍），沉積 100 eV 能量，約 3 個離子對
  - X 射線透過刺沉積了 95% 的能量
- "斑點"：直徑約 7 nm，沉積 100-500 eV 能量，約 12 個離子對
  - 中子和α粒子將大部分能量沉積在斑點中
  - 由於產生的離子對數量更多，DNA 損傷可能比刺中的嚴重得多
來自刺和斑點能量沉積的損傷會導致 DNA 損傷的多個近端位點，稱為區域性多重損傷位點
光子輻射產生的 DNA 損傷頻率
- 平均每個細胞誘導一個致死事件的劑量為D₀劑量；在統計學上，約 37% 的暴露於 D₀ 劑量的細胞群將存活，而其他細胞將積累一個或多個致死事件
- 對於大多數哺乳動物細胞，光子 D₀ 為 1-2 Gy
- 每個細胞的 DNA 損傷數量，在 D₀ 劑量後立即

每個 D₀ (1-2 Gy) 劑量的事件
電離	~100,000/細胞
鹼基損傷	>1000/細胞
單鏈斷裂	~1000/細胞
雙鏈斷裂	~40/細胞
細胞死亡	~0.63/細胞 (SF = 0.37)

DNA 損傷的程度受細胞在電離產生的自由基造成損傷之前清除自由基的能力、足夠靠近 DNA 以造成損傷的電離數量以及 DNA 修復的有效性的影響。因此，自由 DNA 的輻射損傷頻率遠高於細胞 DNA
鹼基損傷和單鏈斷裂
- 通常有效修復
- 與細胞殺傷無關（例如，過氧化氫會產生頻繁的 SSB，但不會導致明顯的細胞殺傷）
- 但是，如果修復不正確，可能會導致 DNA 鹼基序列發生改變，從而導致突變
- 突變頻率通常以劑量依賴的方式增加，但在更高劑量時，致死事件開始占主導地位，存活突變的頻率降低
雙鏈斷裂
- 與導致細胞殺傷的主要因素有關
- 簡單 DSB：定義為單個輻射軌跡導致的兩個單鏈斷裂 (SSB) 在大約 6-10 個鹼基對內發生 (PMID 9652804)
- 複雜 DSB：此外，其特徵在於在斷裂末端附近存在其他 DNA 損傷位點（氧化鹼基損傷、無鹼基 (AP) 位點、單鏈斷裂）
- 輻射會產生一系列結構複雜性 DSB；更高 LET 輻射由於斑點能量沉積會產生更復雜的 DSB。低 LET 輻射也能產生複雜的 DSB
- 鏈末端通常有懸垂，即一條鏈比另一條鏈長几個鹼基，這是由不對稱斷裂造成的
複雜的雙鏈斷裂
- 發生在約 30% 的低 LET 誘導的 DSB 中
- 低 LET 輻射的生存曲線肩部被認為反映了細胞的 DSB 修復能力
- 高 LET 輻射沒有生存曲線肩部可能是由於複雜 DSB 的高結構複雜性和低修復性
- 據推測，在修復簡單的 DSB 後，複雜的 DSB 可能同樣是導致低 LET 輻射造成的大部分細胞殺傷的原因
- 複雜 DSB 中高度相關的鹼基損傷可能是透過非同源末端連線途徑 (NHEJ) 進行修復不良的一個因素
一旦產生了雙鏈斷裂，斷裂的片段可能會有幾種不同的命運
- 以原始構型重新連線 - 這不會對下一次有絲分裂產生持久的影響
- 未能重新連線並保持遊離 - 這會導致下一次有絲分裂發生缺失突變
- 重新連線不同的斷裂染色體或片段 - 這會導致下一次有絲分裂發生染色體/染色單體畸變，具體取決於 DSB 發生在細胞週期的哪個階段
歷史上，染色體畸變是在暴露於輻射後的第一個中期評分的。因此，根據損傷發生在細胞週期的哪個階段，存在兩種型別的畸變
- 染色體畸變 - 兩條姐妹染色單體鏈都受損。損傷發生在染色體複製之前；S 期在新的姐妹染色單體中複製斷裂
- 染色體畸變 - 單條染色單體受損。損傷發生在染色體複製後；互補的姐妹染色單體完好無損
畸變有多種型別，有些是致命的，有些則不是。請參閱 w:染色體異常瞭解更多資訊
- 雙著絲點（染色體，致死）：兩個不同的染色體發生 DSB。長片段（包含著絲粒）不恰當地連線在一起，兩個短片段（無著絲粒）保持遊離。包含兩個著絲粒的長片段被複制。影像
- 環狀（染色體，致死）：一個染色體發生兩次獨立的 DSB，每次在一個臂上。粘性末端可能重新連線形成環，而兩個短片段（無著絲粒）保持遊離。包含單個著絲粒的環被複制。影像
- 後期橋（染色單體，致死）：僅在後期顯現，發生在染色體複製後。兩個染色單體發生 DSB，粘性末端不恰當地連線在一起。在後期，染色體正常分離到相反的兩極是不可能的
- 對稱易位（染色體，非致死）：兩個不同的染色體發生 DSB。斷裂片段被交換，粘性末端重新連線。這可能導致癌基因融合蛋白（例如 bcr-abl）
- 缺失（染色體/染色單體，非致死）：一個染色體發生兩次獨立的 DSB，都在同一個臂上。中間片段脫落，外部片段被不恰當地重新連線。中間片段在下一次有絲分裂中丟失
每個染色體都限制在一個特定的核域內；因此，斷裂之間的相互作用並非完全隨機。活躍的染色體往往是表面積最大的染色體（例如染色體 8）
這些輻射誘發的 DNA 事件構成了線性二次模型的基礎

雙鏈斷裂文獻

NIH
- 評估由靶向特定 DNA 序列的 125I 標記寡核苷酸產生的輻射誘導 DNA 雙鏈斷裂的結構組織
- 2005 PMID 15962759 -- "複雜 125I 誘導 DNA 雙鏈斷裂的表徵：對修復的意義。"(Datta K, Int J Radiat Biol. 2005 年 1 月；81(1)：13-21.)
  - 結論：複雜的 DSB 在 DSB 末端附近具有高度的鹼基損傷聚集
- 2006 PMID 17067210 -- "與位點特異性輻射誘導 DNA 雙鏈斷裂相關的鹼基損傷聚集的分子分析。"(Datta K, Radiat Res. 2006 年 11 月；166(5)：767-81.)
  - 結論：在 I-125 靶鹼基的 8 個鹼基內發生鹼基損傷聚集。鹼基損傷為 8-羥基鳥嘌呤、8-羥基腺嘌呤和 5-羥基胞嘧啶。還有證據表明鹼基損傷 >24 bp 上游，可能是透過電荷遷移機制

MRC；2001 PMID 11604075 -- "確定電離輻射誘導的 DNA 損傷譜的計算方法。"(Nikjoo H, Radiat Res. 2001 年 11 月；156(5 Pt 2)：577-83.)
- 蒙特卡羅軌跡模擬。結論
- (1) 每單位吸收劑量的鏈斷裂產率在很寬的 LET 範圍內幾乎保持不變
- (2) 大多數 DNA 損傷是簡單的型別，儘管大多數 SSB 至少伴隨一個鹼基損傷
- (3) 對於低能電子，大約 20-30% 的 DSB 是複雜的 DSB。隨著 LET 的增加，這一比例會增加，對於 α 粒子，這一比例會達到大約 70%
- (4) DNA 區域性命中區域的損傷程度僅限於幾個鹼基對

哥倫比亞大學；1992 PMID 1351522 -- "與 DNA 雙鏈斷裂相關的多損傷位點能量沉積和目標大小的限制。"(Brenner DJ, Int J Radiat Biol. 1992 年 6 月；61(6)：737-48.)
- 區域性多損傷位點 (LMDS) 是在 1-4 nm 直徑內區域性化的 2-5 個電離的能量沉積

加州大學聖地亞哥分校；1990 PMID 1971840 -- "電離輻射在細胞內產生的 DNA 雙鏈斷裂的產率：綜述。"(Ward JF, Int J Radiat Biol. 1990 年 6 月；57(6)：1141-50.)
- DNA dsb 與劑量呈線性關係；不同細胞型別之間的每劑量 DNA 損傷保持不變
- 放射敏感性的差異歸因於修復速度和/或準確性的差異

DNA 損傷檢測

鹼基損傷

高效液相色譜 (HPLC)
從標記胸腺嘧啶中釋放氚
磷酸釋放
熒游標記

鏈斷裂

對於大多數分析，DSB 在中性 pH (7-10) 溶液中進行評估，而 SSB 在鹼性 pH (~12) 溶液中進行評估
這些分析檢測到的損傷通常在 24 小時內修復

蔗糖梯度分段 - 離心
- 蔗糖溶液，梯度從 5% 到 30% 不等
- 細胞 DNA 被放射性標記（例如 ¹⁴C）
- 誘導細胞裂解，釋放 DNA（根據溶液的不同，為單鏈或雙鏈）到蔗糖溶液中
- 含有 DNA 的蔗糖溶液然後進行離心
- 較大的 DNA 片段穿過蔗糖溶液的方式與小片段不同
- 然後收集流體的餾分，並分析 ¹⁴C 以評估每個梯度水平存在的 DNA 量
- 從片段大小的分佈估計鏈斷裂頻率

核體沉降 - 離心
- 使用蔗糖梯度溶液
- 在高鹽濃度和非離子型去汙劑存在的情況下，在中性 pH 條件下裂解細胞
- 間期核開啟，染色質鏈顯露出來。單個斷裂的鏈稱為核體，由仍然纏繞在殘留蛋白結構上的超螺旋 DNA 組成
- 單鏈 DNA 斷裂使染色質片段能夠放鬆超螺旋並擴大
- 不同大小的染色質片段穿過蔗糖溶液的方式不同
- 有時，會新增熒光染料，可以透過顯微鏡測量產生的光暈 (= 光暈法)

中性濾膜洗脫 - 洗脫
- 孔徑約為 2 mm 的濾膜（DNA 纖維直徑約為 25 nm，小 100 倍）
- 細胞 DNA 被放射性標記（例如 ¹⁴C）
- 誘導細胞裂解，釋放 DNA（根據溶液的不同，為單鏈或雙鏈）到濾膜頂部
- 使用洗脫緩衝液溶液將 DNA 片段洗脫透過濾膜
- DNA 洗脫速率與 DNA 片段大小有關
- 雙鏈斷裂在 pH 7.4-9.6 條件下進行分析，單鏈斷裂在更鹼性的 pH 12.3 條件下進行分析

脈衝場凝膠電泳 (PFGE) - 電泳
- 瓊脂糖凝膠
- 細胞 DNA 被放射性標記（例如 ¹⁴C）或電泳後使用 DNA 特異性熒光染料
- 誘導細胞裂解，釋放 DNA（根據溶液的不同，為單鏈或雙鏈）到瓊脂糖凝膠中
- DNA 片段帶有淨負電荷
- 在瓊脂糖凝膠上施加電場，DNA 片段的移動速度與其大小成反比
- 可以使用恆定場電泳，但透過以不同方向脈衝場以改變遷移軸，可以改善片段的分離

單細胞凝膠電泳 (彗星試驗) - 電泳
- 將細胞嵌入瓊脂糖凝膠中，然後裂解細胞以原位釋放 DNA
- 施加電場，DNA 片段從細胞核中的 DNA 質量向外遷移
- 由此產生的遷移結構的形狀類似於彗星，因此得名
- 雙鏈斷裂在中性 pH 條件下進行分析，而單鏈斷裂在鹼性 pH 條件下進行分析
- 對 SSB 的敏感度很高，但對 DSB 的敏感度沒有那麼高

γ-H2AX 測定 - 免疫組織化學/流式細胞術
- IHC 工作量非常大，不容易在常規實踐中實施，但可以檢測到大約低 10 倍水平的 DNA 損傷
- 該測定是一種高度靈敏的方法，用於檢測單個 DSB 的存在（和/或修復）

染色體畸變

穩定的染色體畸變在暴露後可能持續數月至數年
目視觀察 - 在暴露於電離輻射後的第一次中期
染色體畸變測定 - 透過 FISH 標記的免疫組織化學

人淋巴細胞中的染色體畸變

廣泛用作輻射暴露的生物標誌物
在全身照射暴露後，對外周血淋巴細胞中雙著絲點和環（見上文）的發生率進行評分
- 劑量反應符合線性二次關係
- 低至 0.25 Gy 的劑量可以檢測到，這可用於評估“黑膠片徽章”或潛在事故。
損傷動力學
- 末端缺失 - 單次命中 - 線性響應
- 雙著絲粒染色體、易位、環狀染色體、鏈間缺失 - 兩次命中 - 二次響應
輻射暴露可以隨著時間的推移進行追蹤。
- 成熟淋巴細胞的壽命約為 1500 天（約 4 年），並會慢慢從外周血中消除。因此，成熟淋巴細胞中非對稱畸變（雙著絲粒染色體、環狀染色體）的產量會隨著時間的推移而下降。
- 幹細胞/前體淋巴細胞也會經歷 DNA 損傷，其時間程序根據型別而異。
- 不穩定畸變：非對稱畸變（例如，雙著絲粒染色體、環狀染色體）會殺死細胞，不會傳遞給子代。它們的產量會隨著時間的推移而下降。
- 穩定畸變：對稱易位可能會無限期地持續，因為它們會透過子代進行傳播。它們的產量會隨著時間的推移而保持穩定。
- 廣島倖存者在超過 50 年後的易位發生率與當時接受的全身劑量密切相關。