結構生物化學/化學鍵/二硫鍵/形成二硫鍵的多種方式
研究人員最初認為，酶ERO1，內質網氧化還原酶1，將氧還原與從頭形成的二硫鍵偶聯，但最近發現，缺乏這種酶的哺乳動物仍然存活並形成二硫鍵。這表明存在形成二硫鍵的替代途徑。發現表明，過氧化物酶4參與過氧化物的去除和二硫鍵的形成。哺乳動物 ER 中形成二硫鍵的許多其他不同途徑包括靜止硫醇氧化酶、ER 定位蛋白二硫鍵異構酶過氧化物酶和維生素 K 環氧化物還原酶。這些形成二硫鍵的各種途徑受谷胱甘肽的調節。
許多重要的分泌蛋白和細胞表面蛋白，如抗體、質膜受體和通道、細胞外基質蛋白和血液凝固因子，都含有二硫鍵，因為二硫鍵提高了蛋白質的穩定性並控制了氧化還原依賴性功能。內質網中的二硫鍵經歷一個由 PDI，蛋白二硫鍵異構酶，家族膜催化的過程，然後進行共翻譯轉運到 ER。當多肽開始摺疊時，相互靠近的半胱氨酸殘基會形成二硫鍵，即使它們沒有在最終產物中形成。這些最終沒有摺疊成最終產物的二硫鍵是錯誤摺疊蛋白質問題的原因，但也可能是正常摺疊過程中的中間體。為了獲得最終正確摺疊的二硫鍵，錯誤摺疊的二硫鍵必須在 PDI 家族催化的反應中被分解。因此，PDI 家族在正確形成和還原二硫鍵的過程中起著至關重要的作用，以確保進入內質網的蛋白質正確摺疊。
酶和底物之間二硫鍵的對應關係是形成二硫鍵的催化反應發生所必需的。由於 PDI 家族成員各自至少容納一個硫氧還蛋白結構域，因此 CXXC 基序在其活性位點在二硫醇和二硫鍵狀態之間交替。當二硫鍵轉移到底物蛋白時，活性位點會發生還原。為了使酶能夠進行進一步的氧化，必須對活性位點進行脫氧。最初認為，GSSG，谷胱甘肽二硫鍵，與活性位點如何被再氧化有關。進行體外實驗，結果表明，與內質網中發現的類似的 GSH/GSSG 比例將有效地氧化 PDI 中的活性位點半胱氨酸，從而將二硫鍵轉移到底物蛋白上。這些實驗沒有顯示二硫鍵是如何從頭引入的。隨著 ERO1p，一種稱為內質網氧化還原酶的酵母酶的發現，發現這種酶對於二硫鍵的形成是必要的。ERO1p 在氧化 PDI 方面發揮著重要作用，而不是分泌蛋白質或低分子量分子，如 GSH，並透過將從頭形成的二硫鍵與氧還原為過氧化氫偶聯來催化氧化。雖然 ERO1 被嚴格調控以防止活性氧物種的過度產生，但它展示了二硫鍵是如何從頭形成的，並且還確定了該途徑的最終電子受體。
敲除不同生物體中編碼 ERO1p 的基因，得出了關於其重要性的不同結論。當敲除酵母中編碼 ERO1p 的基因時，它證明了其作為酵母中必不可少的蛋白質的重要性。高等真核生物的敲除結果不同。當在黑腹果蠅中敲除時，這會導致相對溫和的表型，其細胞表面受體 Notch 的摺疊存在一定問題。小鼠和人類中存在兩個 ERO1 旁系同源物，一對基因 ERO1α 和 ERO1β。當敲除 ERO1 β 時，會導致胰島素原摺疊缺陷。ERO1α 被認為驅動其他組織中二硫鍵的形成。發現 ERO1α 和 ERO1β 的雙重敲除不會導致比單獨敲除 ERO1 β 更嚴重的反應。這表明哺乳動物細胞中存在一條 ERO1 獨立的二硫鍵形成途徑，並且雙重敲除細胞有助於重新建立正常的內質網氧化還原條件。
PRDX4
由於 H2O2 也是 ERO1 催化的反應產生時產生的，這表明內質網中可能存在其他蛋白質來去除這種活性氧物種。稱為過氧化物酶的酶代謝 H2O2 繼而形成二硫鍵。PRDx4 在 H2O2 去除和二硫鍵形成方面均具有活性。研究表明 PRDx4 在從頭形成二硫鍵方面有新的職責。由於 PRDX4 和內質網內的幾個 PDI 家族成員以及等效物，這表明該酶是一種豐富的內質網駐留蛋白。在 PRDX4 在兩種蛋白質等濃度孵育期間被一些 PDI 家族成員有效還原的情況下，一些 PDI 蛋白被氧化。這表明，即使 GSH 本身是一種還原劑，但當包括 PDI 時，PRDx4 還原的效率會提高。這表明 PRDx4 和 GSH 之間的二硫鍵交換形成 GSSP 取決於 PDI 的存在。如果 PRDX4 被 PDI 家族成員還原，分泌蛋白中會快速形成二硫鍵。這些結果得到了體外證據的證實。由於 PRDX4 增強了 ERO1 的溫度敏感突變體，因此酵母在非允許溫度下會發生存活和二硫鍵形成。但是，過表達 PDI 家族成員也會導致 PRDx4 在內質網中還原能力的下降或增加。總之，透過結合 ERO1 和 PRDX4 途徑，每個被還原的氧分子會導致兩個二硫鍵的引入，因此使整個過程比單獨使用 ERO1 更有效。
GPX7 和 GPX8
GPX7 和 GPX8 是同源酶，屬於硫氧還蛋白 GPX 樣過氧化物酶家族，它們也可以還原 H2O2。它們是 PDI 過氧化物酶，將 H2O2 的還原與某些 PDI 家族成員的氧化偶聯。在這些 GPX 存在的情況下，某些 PDI 家族成員很容易被氧化。在 GPX 和 PDI 都存在的情況下，由 H2O2 介導的還原模型蛋白的氧化重摺疊過程會更快。雙分子熒光互補顯示了 ERO1α 與細胞中兩種 GPX 的物理關聯。新增 GPX7 後，ERO1α 消耗的氧氣體外速率增加，表明在其存在下過程效率更高。這些生化結果表明 GPX7 和 GPX8 在二硫鍵形成中起著重要作用。
QSOX
Erx2p，一種硫醇氧化酶，過表達可以抑制 ero1-1 突變。這條不同的途徑表明，替代蛋白質可能潛在地完成酵母和其他生物體中 ERO1 的基本功能。QSOX，一種已知在體外將二硫鍵引入蛋白質的黃素蛋白，類似於 Erv2p。QSOX 透過將二硫鍵氧化與氧還原偶聯以形成 H2O2 來催化從頭形成的二硫鍵。與 ERO1 不同，ERO1 專門氧化只有 PDI 家族成員，而 QSOX 的底物特異性更廣，可以將二硫鍵引入蛋白質底物中。但是，PDI 能夠大大增強天然二硫鍵的形成，因為 QSOX 不能異構化非天然二硫鍵。當過表達時，QSOX 能夠補充 Δero1 酵母菌株。這表明 QSOX 在體內參與二硫鍵的形成。當 ERO1 和 QSOX 都被敲除時，會比單獨敲除 ERO1 出現更嚴重的表型，表明 QSOX 在 ERO1 缺失時可能提供一些功能。由於其混雜的底物特異性和在分泌途徑中的位置，QSOX 目前仍然是獨立於 ERO1 的從頭形成的二硫鍵的候選者。
VKOR
VKOR 酶展示了另一個潛在的 ERO1 獨立的二硫鍵形成途徑。VKOR 是內質網中的一個四跨膜螺旋蛋白。VKOR 的功能是催化維生素 K 環氧化物的兩步還原，從而生成維生素 K 氫醌。當維生素 K 環氧化物被還原時，VKOR 中的 CXXC 基序隨後被氧化形成二硫鍵。VKOR 家族中的成員將這種二硫鍵與硫氧還蛋白樣氧化還原酶交換，以氧化底物蛋白。由於人類 VKOR 不含硫氧還蛋白結構域，因此 PDI 家族成員反而充當 VKOR 底物。當活性位點 CXXA 突變體過表達時，VKOR 會被困在與 PDI 家族成員的混合二硫鍵複合物中，主要是跨膜結合的 TMX 和 TMX4。這些實驗的結果表明，VKOR 持續形成二硫鍵尚不清楚，但證明了一條潛在的途徑。
鑑於存在多種潛在的二硫鍵形成途徑，現在需要確定它們的相對貢獻。ERO1途徑是在正常生理條件下形成二硫鍵的重要途徑。細胞中TRDX4過度氧化表達了ERO1的失控形式，表明該酶在內質網中活性，並具有產生過氧化氫的能力。儘管哺乳動物不一定需要這條途徑，但如果它不存在，將損害二硫鍵的形成。ERO1在決定細胞中PDI的氧化還原狀態方面很重要，並且還會與PDI形成混合二硫鍵。這表明ERO1具有氧化PDI的能力。如果動物沒有ERO1來生存，但仍然能夠形成二硫鍵蛋白，則表明存在其他途徑。它們各自的貢獻仍需進一步探索。
PRDX4依賴性途徑對二硫鍵的形成沒有顯著貢獻。如果它確實有貢獻，那麼可以預測Prdx4敲除小鼠應該表現出嚴重的表型。儘管Prdx4敲除小鼠存活，但由於睪丸的氧化應激而導致不育。因此，PRDX4途徑被認為對於特定組織的正常功能至關重要，但並非生存所必需。如果在高等真核生物中存在更高濃度的PRDX4，則表明ERO1敲除的輕微表型，因為PRDX4途徑可以使用可獲得的過氧化氫作為替代來源。需要更多研究來確定哪些來源提供了驅動二硫鍵形成所需的H2O2。即使PRDX4為ERO1提供了二硫鍵形成的替代途徑，也需要確定PRDX4途徑的重要性。
在內源性水平下，GPx7和GPx8酶不能在ERO1敲除細胞中取代PrdxIV。這些酶可能與PRDX4具有相似的功能。研究表明，過氧化還原蛋白家族的蛋白質對H2O2的反應速度高於GPXs。有證據表明，Ero1α在體內與GPXs的相互作用可以彌補其相對較慢的反應速度。為了解釋這些酶在從頭二硫鍵形成中的作用，需要進一步瞭解它們的特徵。目前的研究表明，VKOR在二硫鍵形成中的細胞功能基本上尚未被闡明。然而，在VKOR中，與PDI家族成員形成的混合二硫鍵確實暗示其在該過程中的作用。由於其通量較低，VKOR氧化PDI的途徑與γ-羧基穀氨酸形成嚴格耦合並不重要。如果氫醌可以透過另一種電子受體重新氧化，情況並非如此。這可能會在該途徑中發揮更重要的作用。
如體外實驗所示，H2O2直接氧化PDI和底物蛋白中的半胱氨酸以形成二硫鍵可能發生。然而，這些途徑被證明並不重要，因為當反應混合物中同時存在H2O2和PDI家族成員以及PDI過氧化物酶或PRDX4時，底物重摺疊的動力學更快。脫氫抗壞血酸是內質網中氧化當量的另一個來源。DHa可以從胞質溶膠轉移到內質網，在內質網中生成，並且像H2O2一樣，DHa直接氧化PDI並在體外使還原的蛋白質展開。由於其速度較慢，前一條途徑被證明不是還原DHa的主要途徑。一條更快的途徑是蛋白質底物的PDI無關氧化，其速度更快。
參考文獻
[edit | edit source]Bulleid NJ, Ellgaard L. Trends Biochem Sci. 2011 Sep;36(9):485-92. Epub 2011 Jul 19. Review. PMID: 21778060 [PubMed - indexed for MEDLINE]a http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21778060