結構生物化學/色譜法/柱
柱色譜法是另一種用於分離蛋白質或其他分子的方法。它本質上是薄層色譜法（TLC）的倒置版本 - 依賴於相同的物理原理，只是 TLC 是透過毛細管力驅動溶劑移動的，而柱色譜法則依靠重力驅動洗脫液向下流動。在這種方法中，待分離的樣品被施加到玻璃柱的頂部。然後，玻璃柱被裝填有固相。這種固相的目的是將樣品中的化合物分離成不同的區域。矽膠 (SiO2) 和氧化鋁 (Al2O3) 是常見的吸附劑。預計首先從柱中洗脫的成分是與矽膠相互作用最少的成分，因此也是極性最小的成分。洗脫液將可溶性化合物帶走。當柱中填充矽膠時，預計首先從柱中洗脫的成分是與矽膠相互作用最少的成分，因此也是極性最小的成分。洗脫液將可溶性化合物帶走。洗脫液的極性可以從非極性溶劑逐漸增加到極性溶劑，因為隨著非極性成分的先被收集，留在柱中的成分帶就更極性。更極性的溶劑將更有效地帶走留在柱中的極性成分。在使用柱色譜法根據各自極性分離混合物後，應使用薄層色譜法來分離混合物，以觀察餾分的分離情況，並將任何“爬”到相同距離的餾分組合在一起。使用 TLC 發現具有相同極性的化合物被組合在一起，並透過測量其熔點並與文獻值進行比較來進行分析。樣品量用於計算原始樣品中每種成分的初始濃度。如果化合物是彩色的，這很容易做到，但如果化合物是透明溶液，則可以進行 CAM 染色（也可以使用碘）或在紫外線下追蹤其位置。在收集這些帶後，可以將溶液置於旋轉蒸發器中以蒸發掉溶劑，得到純化合物。如果溶劑易揮發，可以在通風櫥中或過夜蒸發。樣品也可以在沙浴中加熱。
一旦用乾燥的固定吸附劑材料（如矽膠）裝填柱後，通常有兩種方法進行柱色譜：溼裝填和幹裝填。混合物在極性或非極性溶劑中的溶解能力決定了柱色譜法的方法。
- 在溼裝填方法中，吸附劑懸浮在溶劑中，並將漿液作為洗脫液轉移到柱中。這種方法最常用於所需分離混合物可溶於極性最小的溶劑或非極性溶劑的情況下。如果使用過量的極性溶劑，則它會留在柱內並增加區域性極性，這會導致柱上的分離混合在一起。
- 在幹裝填方法中，混合物首先溶解在最小量的溶劑中，並加入吸附劑材料。一旦溶劑與混合物和吸附劑混合並蒸發，乾燥的化合物就可以加入到柱中。在加入乾燥的化合物後，用流動相（可以是具有不同極性的極性溶劑，但應以增加的極性順序新增）沖洗柱，並且在新增流動相後，不允許柱變幹。這種方法最常用於混合物僅可溶於比所選洗脫液更極性的溶劑中。
化學化合物在柱內分離並收集。然後可以測試分離後的樣品的純度和其他性質。當樣品施加到柱頂時，它也會用溶劑洗滌。當樣品在柱內的固相上移動時，樣品中的不同分子或化合物將開始彼此分離形成區域。樣品中的化合物將與固相結合，但樣品也會從固相釋放，然後與流過它的液體溶劑結合。這是一個連續的過程。一種化合物將與固相結合，然後釋放並與溶劑結合。然後它會重新結合到固相，然後再次結合到液體溶劑。這個過程隨著化合物向下移動柱子而不斷發生。樣品中不同的分子將對固相或液相具有不同的結合親和力，這些親和力的差異使得混合物中的分子以不同的速度移動並與其他化合物分離。（注意：*以上部分是對有機化學中柱色譜法的描述。）這種方法在生物化學中被稱為反相色譜法。
決定化合物移動距離的因素有 1）溶劑與吸附層之間的相互作用，2）溶質與吸附層之間的相互作用，3）溶質、溶劑和吸附層的極性，以及 4）溶液的重量。為了確定化合物移動的距離，可以計算滯留因子（Rf）。Rf 值可以透過檢視在執行柱後收集的餾分點樣的 TLC 板來找到。Rf 值是溶質移動的距離與溶劑移動的距離之比。Rf 的範圍是 0 到 1。如果計算出的 Rf 值高於預期，則在執行柱時應使用更少的極性溶劑。
有機化學實驗室第三版，包括定性分析，作者：Bell Jr, Charles E; Taber, Douglas F.; Clark, Allen K. Harcourt College 出版社