結構生物化學/DNA修復/多核苷酸激酶/磷酸酶在DNA鏈斷裂修復中的作用
DNA鏈斷裂通常是由內部和外部因素引起的。在這些鏈斷裂後，它們需要在被DNA聚合酶替換缺失的核苷酸並被DNA連線酶重新連線之前進行處理。多核苷酸激酶/磷酸酶在修復DNA鏈斷裂中起著重要作用，它透過催化DNA末端的恢復來發揮作用。除此之外，PNKP還透過與其他DNA修復蛋白（如XRCC1和XRCC4）的相互作用，幫助其他DNA修復途徑。PNKP在維持正常組織（如發育中的神經細胞）的基因組穩定性、增強癌細胞對基因毒性治療劑的抵抗力方面很重要。
當細胞DNA受到損傷時，會導致衰老、癌症的病因和治療以及神經系統疾病。DNA損傷有不同的形式，如：鹼基修飾和鹼基丟失以及鏈斷裂。這些損傷可能是由細胞內因素（如初級活性氧物種（ROS））和外源因素觸發的。為了保護自己免受這種損傷，細胞已經進化出一系列修復途徑。這些途徑可以抵消由於DNA損傷而產生的突變和細胞毒性後果。導致鏈斷裂的各種機制包括：透過物理和化學手段（如電離輻射 (IR) 和 ROS）以及酶促過程進行切割。因此，鏈斷裂呈現出多種形式，不同的鏈斷裂可以根據其末端的性質進一步分類或細分。PNKP 酶具有 5'-激酶和 3'-磷酸酶活性，這對處理單鏈和雙鏈斷裂末端至關重要。對 PNKP 的研究表明，這些酶的小分子抑制劑會使細胞對 IR 或化療藥物敏感。研究人員還發現，導致 PNKP 發生改變的突變，類似於編碼其他鏈斷裂修復蛋白的其他基因的突變，與嚴重的常染色體隱性遺傳神經系統疾病有關。
電離輻射 (IR) 透過產生羥基自由基，導致具有各種末端基團的 3'-末端發生鏈斷裂。透過產生羥基自由基，脫氧核糖基團內不同碳原子的反應會產生兩個主要的末端基團：磷酸鹽和磷酸乙醇酸。磷酸乙醇酸的形成取決於氧氣的存在，而 3'-磷酸基團是在常氧和缺氧條件下產生的。另一方面，在 5'-末端，主要的末端基團是磷酸鹽。除了引起鏈斷裂外，電離輻射還會產生複雜的病變。這些區域包含兩個或多個緊密排列的受損鹼基或鏈斷裂，以及單一受損位點。複雜的病變包括法蘭克 DSB，SSB:DSB 比率確定為約 25:1。另一個導致鏈斷裂的因素是過氧化氫。與 IR 介導的損傷類似，過氧化氫引起的法蘭克 DSB 遠少於 IR 介導的損傷。博來黴素是一種化療藥物，還會在 3'-磷酸乙醇酸末端產生 DSB。
拓撲異構酶 1 產生一個帶有 5'-OH 末端的 DNA 切口，並與共價 3'-磷酸-酶中間體連線，以緩解扭轉應力。使用拓撲異構酶，喜樹鹼阻止了由此產生的鏈重連，留下了一個 DNA-酶“死衚衕”複合體。透過酪氨酸-DNA 磷酸二酯酶水解這種複合體，會產生更多帶有 3'-磷酸和 5'-OH 末端的切口。
使用 DNA 糖基化酶，可以去除受損的鹼基。然後，無鹼基位點被兩類酶中的其中一類切割。其中一類酶，AP 核酸內切酶，水解 3' 到無鹼基位點的磷酸二酯鍵，以產生 3'-OH 和 5'-脫氧核糖磷酸末端。透過使用 DNA 聚合酶 β，5'-脫氧核糖磷酸末端可以轉化為 5'-磷酸。AP 裂解酶透過 β-消除反應，切割 3' 到無鹼基位點的磷酸二酯鍵，在一個末端產生與 3'-磷酸連線的 β-不飽和醛，在另一個末端產生 5'-磷酸。由於許多 DNA 糖基化酶具有這種酶活性，因此戊烯醛部分可以被 AP 核酸內切酶消除以產生 3'-OH，或者被 AP 裂解酶消除以產生 3'-磷酸。NEIL1 和 NEIL2 酶是具有 β,δ-裂解酶活性的哺乳動物 DNA 糖基化酶，它們能去除大量的突變和細胞毒性氧化嘧啶損傷以及嘌呤衍生的甲醯胺嘧啶。
PNKP 構成一個多域酶。它包含 2 個域：一個 N 端叉頭相關 (FHA) 域和一個 C 端催化域，該催化域由融合的磷酸酶和激酶亞域組成。使用靈活的多肽段將兩個域 FHA 和催化域連線在一起。這種靈活的多肽段可選擇性地結合 XRCC1 和 XRCC4 中的酸性酪蛋白激酶 2 (CK2) 磷酸化區域。XRcc1 和 XRCC4 是重要的支架蛋白，可修復 DNA SSB 和 DSB。Aprataxin 和 APLF 是 DNA 修復因子，也包含 FHA 域，同樣結合 CK2 磷酸化的 XRCC1 和 XRCC4。這種功能可能導致這些蛋白質的協調調節，從而導致磷酸化支架因子的結合。PNKP 和 T4 多核苷酸激酶在其催化域中是相似的，因為它們都包含連續的激酶和磷酸酶域，但不同之處在於 T4 酶缺乏 FHA 域，並且激酶亞域位於磷酸酶亞域的 N 端。
小鼠 PNKP 蛋白的兩個催化活性位點位於蛋白質的同一側。小鼠和 T4 激酶亞域共享一個類似的雙重活性位點裂縫結構，該結構具有獨立的 ATP 和 DNA 結合位點。ATP 結合位點的結構包括 Walker A（P 環）和 B 基序，這些基序在各種激酶中都是保守的。此外，它還攜帶一個天冬氨酸，該天冬氨酸啟用 5'-羥基，以攻擊 ATP γ-磷酸。哺乳動物和噬菌體酶之間的 DNA 結合位點不同。雖然噬菌體 PNK DNA 結合裂縫形成一條通向保守的催化天冬氨酸殘基的狹窄通道，該通道可容納單鏈底物，但哺乳動物酶磷酸化切割、缺口或雙鏈斷裂（DSBs）中具有單鏈 3' 懸垂端的 5' 羥基末端，因為單鏈 5' 末端的磷酸化效率較低。一個由兩個不同的帶正電荷表面組成的寬闊 DNA 識別溝，選擇性地識別較大的雙鏈 DNA 底物。透過使用來自小角度 X 射線散射實驗的結構資訊，再加上氨基酸取代對激酶表面的影響，研究人員發現 DNA 底物以確定的方向跨越這些表面結合。
許多磷酸酶採用的典型過程是滷代酸脫滷酶摺疊。這些酶採用的機制依賴於 Mg2+，同時透過催化天冬氨酸和醯基磷酸中間體進行。哺乳動物 PNKP 在多種 3'-磷酸末端上執行其過程，例如那些位於切口、缺口、DSBs 和單鏈末端內的末端。兩個被大的帶正電荷環包圍的狹窄通道形成通往磷酸酶活性位點的通路，但不足以容納雙鏈底物。這表明為了容納雙鏈底物，需要對磷酸酶底物結合表面的重塑或 DNA 的解旋。
DNA 修復支架蛋白 XRCC1 和 XRCC4 與 PNKP 功能相互作用，這是由 PNKP FHA 結構域與 XRCC1 和 XRCC4 上的磷酸化基序結合介導的。FHA 結構域是磷酸肽結合模組，具有 β-三明治摺疊，其中一系列環從 β-三明治的一側突出並提供一個肽結合表面，該表面對包含磷酸蘇氨酸殘基的目標具有明顯的偏好。即使 XRCC1 和 XRCC4 在結構上不相關，但它們共享類似的基序，這些基序被 CK2 磷酸化並充當 PNKP FHA 結構域的結合位點。當 XRCC1 中殘基 515 和 526 之間的 CK2 磷酸化位點簇（該簇對於與 PNKP 的相互作用是必需的）發生氨基酸取代時，SSB 修復效率會顯著降低。同樣，XRCC4 中的一個主要 CK2 位點 THr233 對於 PNKP 結合和體內高效修復 DSBs 是必需的。在這些位點周圍顯示出顯著的序列保守性。保守的絲氨酸發生磷酸化，並且該複合物相對於主要磷酸蘇氨酸的結構揭示了該殘基與 PNKP FHA 結構域的 ARG35 或 ARg44 之間的動態相互作用。酪氨酸殘基在 -4 位點是保守的，而天冬醯胺殘基在 +3 位點是保守的。一些反應在 FHA 結構域中與 XRCC4 的複合物中不保守。+3 位點的殘基是穀氨酸。由於肽的酸性性質和殘基之間的長程靜電相互作用，帶正電荷的肽結合表面主要有助於結合特異性。+4 位點的蘇氨酸磷酸化也透過募集第二個 PNKP FHA 結構域在結合選擇性中起作用。
PNKP 和單鏈斷裂修復 (SSBR)
[edit | edit source]多酶通路 SSBR 使用不同的參與者，具體取決於致病因子。例如，IR 誘導的鏈斷裂，涉及丟失至少一個核苷酸。由酶聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）、XRCC1、AP 核酸內切酶 1 和 PNKP 負責斷裂末端處受損鏈的識別和校正，而其他蛋白質則充當這些功能的備份。透過使用涉及 DNA 聚合酶 β 和 DNA 連線酶 III 的短補丁通路或使用 DNA 聚合酶 δ 和/或 ɛ、FEN1 核酸內切酶和 DNA 連線酶 I 的長補丁通路，可以連續替換核苷酸和鏈重新密封。當發生 IR 時，APE1 去除 3'-磷酸甘油酸，而 PNKP 水解 3'-磷酸基團。當 APE1 的 3'-磷酸酶活性遠弱於 PNKP 時，就會發生這種情況。PNKP 酶還在確認 5'-OH 末端被磷酸化方面發揮作用。由於 PNKP 的磷酸酶活性遠高於激酶活性，因此當鏈斷裂同時具有 3'-磷酸和 5'-OH 末端時，PNKP 的活性優先考慮。在哺乳動物細胞中，當磷酸酶缺陷型 PNIKP 的過表達無法補償 Xrcc1 缺陷時，PNKP 中的磷酸酶活性被證明對快速修復過氧化氫誘導的 SSBs 至關重要。相應地，PNKP 磷酸活性的另一個重要因素涉及一種小分子抑制劑，該抑制劑顯著阻礙了受照射人細胞中的 SSBR。雖然這裡表明 PNP 中存在重要的磷酸酶活性，但 5'-激酶活性的生理重要性尚未確定。
輻射誘導的 SSBS 修復的普遍接受的模型是 SSB 催化 ADP-核糖鏈在受體染色質蛋白和自身上的聚合。透過這樣做，SSBR 會吸引支架蛋白 XRCC1，並且可能還會緊密結合 DNA 連線酶 III。然後，這些蛋白質反過來募集 PNKP 或 APE1，以恢復 DNA 聚合酶 β 所必需的末端基團，以便它可以新增缺失的鹼基並允許 DNA 連線酶 III 重新連線鏈。透過研究和分析蛋白質-蛋白質相互作用，發現 XRCC1 與 PNKP 之間存在直接相互作用，以及與 DNA 聚合酶 β 和 DNA 連線酶 III 之間的相互作用。這表明這些連線的夥伴關係包括四種蛋白質之間的四聚體複合物。這種形成可以為各種模型形成。雖然有證據表明 XRCC1 和 PNKP 之間存在相互作用，但也存在證據反駁了 XRCC1 募集 PNKP 或 APE1 到鏈斷裂處的概念。透過使用將蛋白質交叉連線到 DNA 底物的技術，進行了實驗以追蹤 HeLa 細胞中 SSBR 蛋白的時序關聯。透過這種孵育過程，發現對於具有 3'-磷酸甘油酸末端或 3'-磷酸末端的底物，APE1 和 PNKP 在 XRCC1/DNA 連線酶 III 之前被募集到鏈斷裂處。除了這一發現，還發現 APE1 或 PNKP 的免疫耗竭減少了 XRCC1 對以下底物的結合。這表明 APE1 和 PNKP 將 XRCC1 誘導到氧化損傷部位，而不是反之。相反，發現在表達 XRCC1 的過氧化氫處理的細胞的細胞核中存在 PNKP 灶，但在缺乏 XRCC1 的細胞中不存在。這表明，雖然在 PNKP 或 APE1 的起始階段可能不需要 XRCC1，但它加速了這些特定酶在染色體損傷部位的灶狀積累和激發。
即使 DNA 修復蛋白 XRCC1 缺乏固有的酶活性，它也能夠增強 PNKP 的激酶和磷酸酶活性。透過使用熒光測量來確定 PNKP 與模擬不同鏈斷裂的底物之間的結合機制，發現了圍繞 XRCC1 誘導的刺激的機制。即使 PNKP 與具有 5'-OH 末端的切口底物緊密結合，Kd 值為 0.25 μM，但這僅比 PNKP 與帶有 5'-磷酸的相同雙鏈體結合緊密 5-6 倍。這表明 PNKP 仍然與它自身的激酶活性的產物結合。結果表明，XRCC1 的存在不影響 PNKP 與非磷酸化底物的結合。但進一步的結果還表明，PNKP 與磷酸化雙鏈體的相互作用被廢除了，因此表明 XRCC1 確實影響了結合並將 PNKP 從反應產物中置換出來。透過跟蹤在限制性酶濃度下產物積累的動力學證據，證實了新增 XRCC1 會增加 PNKP 酶週轉的結果。進一步的資料表明，對於 PNPK 磷酸酶活性，觀察到了類似的動力學資料。
PNKP 與 XRCC1 之間的關係進一步複雜化，因為 CK2 介導的 XRCC1 磷酸化。雖然促進與其他蛋白質的相互作用，但 XRCC1 磷酸化也起作用穩定 XRCC1-DNA 連線酶 III 複合物。在體外發現了 CK2 介導的 XRCC1 磷酸化的多個位點，這些位點聚集在特定位置內。為了將 XRCC1 和 PNKP 募集到過氧化氫處理或 γ 輻射細胞的核灶中，需要 XRCC1 磷酸化。XRCC1 磷酸化也需要促進 SSBs 的更快速修復。如果細胞缺乏 XRCC1 磷酸化，這不會影響細胞存活。但透過進一步的研究和分析，發現沒有功能性 XRCC1 的細胞（具有三突變 XRCC1）將無法完全恢復快速的 SSBR，這表明確實存在與 PNKP 的重要相互作用。透過過表達 PNKP 可以輕鬆完成細胞的修復。這表明 XRCC1 在增加 PNKP 酶週轉方面發揮著重要作用，尤其是在細胞中包含限制性的 PNKP 濃度時。
與未磷酸化XRCC1相比，CK2對XRCC1的磷酸化促進了體外測量的PNKP的激酶和磷酸酶活性。相反，未磷酸化XRCC1的刺激是由於PNKP的酶促週轉率增強。這種情況帶來了問題，因為可以看出磷酸化和未磷酸化XRCC1以不同的位點和不同的親和力結合PNKP，但兩者都能透過類似的機制刺激PNKP。研究發現，磷酸化XRCC1與FHA結構域結合的Kd值為4 nM，而未磷酸化蛋白質與PNKP的催化結構域結合的親和力弱10倍。這表明在人細胞中存在PNKP和XRCC1之間可能存在獨立於磷酸化的相互作用。研究人員發現，PNKP與在人293T細胞中表達的XRCC1三突變體共免疫沉澱。雖然細胞XRCC1的85-90%是磷酸化的，但這並不意味著與FHA結構域相互作用的關鍵氨基酸簇完全被磷酸化。該簇磷酸化的增加以及PNKP與XRCC1共純化的約3倍增加是由於用過氧化氫處理細胞所致。這表明細胞可能在增強CK2介導的XRCC1磷酸化及其隨後與PNKP FHA結構域的相互作用方面發揮作用。這種增強直接響應於過氧化氫或輻射的對抗，以有效地處理相當高水平的DNA損傷。另一方面，未受應激的細胞能夠透過不同的方法來應對相對較低的內源性DNA損傷水平。透過使用未磷酸化的XRCC1，或磷酸化程度有限的XRCC1，它能夠透過與催化結構域結合來啟用PNKP。
由於細胞中PNKP的耗竭和裂殖酵母中Pnk1的缺失，細胞對喜樹鹼敏感。XRCC1透過與TDP1、DNA連線酶III和PNKP形成複合體，忽視了這些斷裂的修復。神經退行性疾病，伴有軸索神經病變的脊髓小腦共濟失調1型，是由TDP1突變引起的。研究表明，SCAN 1細胞修復喜樹鹼誘導的SSB的能力降低，並且修復過氧化氫誘導的SSB的速度也較慢。這一證據表明，TDP1對於修復由氧化過程產生的損傷至關重要，這些損傷可能解釋了SCAN1中觀察到的神經退行性變。裂殖酵母G0中Tdp1和Pnk1實驗表明了這一點，它們按順序起作用以處理天然發生的SSB的3'末端。
PNKP和鹼基切除修復（BER）
[edit | edit source]細胞機制BER，鹼基切除修復，負責修復由IR、ROS和烷化劑決定的大多數次要鹼基修飾。該機制的第一步是透過DNA糖基化酶去除修飾的鹼基，然後使用APE1在新形成的無嘌呤/無嘧啶（AO）位點切割DNA。另一種方法是使用糖基化酶以其AP裂解酶活性水解AP位點。隨著nei核酸內切酶VIII樣-1（NEIL1）和NEIL2哺乳動物DNA糖基化酶的發現，PNKP參與BER途徑是無可爭辯的。nei核酸內切酶VIII樣-1（NEIL1）和NEIL2哺乳動物DNA糖基化酶具有β,δ-AP裂解酶活性，產生3'磷酸末端。這些糖基化酶不是直接與PNKP結合，而是與包含其他BER成分（包括PNKP）的大型複合體相關聯。這些糖基化酶的功能是承擔各種鹼基損傷，包括：胸腺嘧啶乙二醇、5-羥基尿嘧啶和8-氧鳥嘌呤。除了此功能外，糖基化酶還可以切割由不具有AP裂解酶活性的糖基化酶產生的完整無鹼基位點，以及由其他DNA糖基化酶的β-消除AP裂解酶產生的戊烯醛部分。由於此NEIL糖基化酶將與APE1競爭，從而形成不同的、獨立於APE1的BER途徑的基礎。雖然目前的研究無法表明NEIL1或NEIL2催化的無鹼基位點切割在細胞中出現的程度，但這些位點的切割可能解釋了PNKP耗竭的細胞對烷化劑甲基甲磺酸鹽（MMS）敏感性增加的原因。這種對MMS的敏感性在實驗中令人驚訝，因為該試劑造成的重大損傷是N7-甲基鳥嘌呤和N3-甲基腺嘌呤，幾乎沒有直接的鏈斷裂。下調Aprataxin的表達也會導致細胞對MMS敏感。但是，由於人類DNA糖基化酶負責去除這些甲基化的鹼基，而不具有AP裂解酶活性，因此MPG產生的無鹼基位點生成具有3'磷酸末端的斷裂的能力必須歸因於NEIL1或NEIL2。
PNKP和雙鏈斷裂修復（DSBR）
[edit | edit source]在兩個主要的雙鏈斷裂修復途徑中，有證據表明PNKP參與非同源末端連線。但是，相反，由於PNKP缺失未能影響IR誘導的姐妹染色單體交換，這表明PNKP可能實際上不參與同源重組。除了其他途徑外，PNKP還充當備用的、依賴XRCC1的DSB修復途徑。實驗透過使用人類細胞無細胞提取物顯示了PNKP參與的證據。這些證據表明，在結合具有5' -OH末端的線性化質粒底物之前，需要PNKP激酶活性。XRCC4和DNA-PK對於確定磷酸化的成功程度至關重要。與XRCC1將PNKP與DNA連線酶III連線的作用類似，XRCC4將PNKP與DNA連線酶IV連線。CK2介導的XRCC4 Thr233磷酸化在與PNKP FHA結構域相互作用以及順利刺激XRCC4-DNA連線酶IV介導的5'去磷酸化質粒底物的體外連線方面發揮作用。在Xrcc4缺陷細胞系中，當表達XRCC4而不是野生型XRCC4時，照射後存活率降低了約30%，從而減緩了DSB修復的速度。
透過生物物理和生化檢查確定了XRCC4-PNKP相互作用的功能作用。雖然XRCC4的磷酸化支援與PNKP的緊密親和力，但未磷酸化的XRCC4也能夠與PNKP結合。雖然在這種特定情況下，結合是與PNKP的催化結構域結合，從而削弱了親和力。類似於XRCC1刺激PNKP從SSB週轉的能力，未磷酸化的XRCC4能夠刺激pNKP從DSB的酶促週轉。研究發現，磷酸化的XRCC4的存在未能刺激PNKP，因此阻止了PNKP介導的DNA磷酸化。但是，隨著DNA連線酶IV的額外加入，它與磷酸化的XRCC4形成的複合物能夠逆轉抑制並刺激PNKP週轉。在HeLA細胞中的蛋白質中發現XRCC4：DNA連線酶IV：PNKP的比例約為7:1:3，其中幾乎一半的XRCC4在Thr233處被重要地磷酸化。這表明在細胞中，只有一部分XRCC4可以與DNA連線酶IV複合，從而表明XRCC4和PNKP之間可能存在獨立於FHA的相互作用。使用XRCC4與PNKP的共免疫沉澱，證實了XRCC4和PNKP之間獨立於FHA的相互作用，用於在耗盡內源性PNKP的細胞中表達。PNKP還具有處理DSB 3'磷酸乙醇酸末端的重要功能，尤其是3'懸垂和鈍端末端。這些末端是由IR、博來黴素和烯二炔化合物（如新癌黴素）產生的。即使APE1能夠去除SSB末端和凹陷DSB末端的磷酸乙醇酸基團，但在鈍端DSB末端，它會失去其有效性，而在懸垂末端，它完全無效。
PNKP的生理作用和臨床潛力
[edit | edit source]PNKP參與多個DNA修復途徑，以保護細胞免受內源性和外源性基因毒性物質的影響。當NHEU基因和SSBR/BER基因發生破壞時，會出現各種症狀的神經系統疾病。一個例子是微腦畸形。在編碼DNA連線酶IV的LIG4發生突變的人群中，會出現微腦畸形。小鼠中Xrcc1的缺失會導致癲癇發作。研究發現，PNKP突變是導致一種嚴重的神經系統常染色體隱性遺傳疾病的原因，該疾病的特徵是微腦畸形。症狀包括難治性癲癇發作和發育遲緩。透過對家族的分析，在激酶和磷酸酶結構域中都發現了突變。透過收集所有MCSZ患者表現出的症狀，表明PNKP參與了多種DNA修復途徑。
PNKP也被證明與病理生理狀況相關。觀察到，PNP在關節纖維化組織中的表達升高表明PNKP在減輕巨噬細胞產生的ROS的影響方面發揮作用。在另一項實驗中也觀察到，生理上和環境上相關的鎘和銅劑量已知會引起神經毒性和致癌作用，從而抑制PNKP。
腫瘤細胞的 DNA 修復能力在臨床對許多抗腫瘤藥物的反應中起著重要作用。因此，目前正在研究幾種 DNA 修復酶，例如 PNKP 的抑制劑。這些抑制劑具有使細胞對輻射和化療藥物敏感的能力，因此對研究具有重要意義。透過這項研究，研究人員發現了一種小分子抑制劑，能夠抑制 PNKP 磷酸酶活性，並增強細胞對 IR 和喜樹鹼的敏感性。喜樹鹼是兩種臨床常用的拓撲異構酶 I 毒物——伊立替康和拓撲替康的母體化合物，這兩種藥物常用於治療結腸癌和卵巢癌。
PNKP 是一種重要的酶，參與細胞對斷裂鏈末端的加工。PNKP 由於其有益的特性而參與許多 DNA 修復途徑。需要進一步研究以確定 PNKP 的調控機制、與其他修復酶的協作機制以及在神經元和其他組織中的生理作用。PNKP 被認為是癌症治療中的一個治療靶點，因為它參與多種修復途徑。因此，需要識別、研究和最佳化新的抑制性化合物以用於臨床。進一步的研究應投入到識別 PNKP 的合成致死伴侶，以觀察其作為單一藥物針對缺乏蛋白的腫瘤的潛在應用。
Weinfeld, Michael. "Tidying up loose ends: the role of polynucleotide kinase/phosphatase in DNA strand break repair." Trends in Biochemical Sciences 36.5 (2011): 262-71. PubMed. Web. 21 Nov. 2012.