結構生物化學/DNA重組技術/DNA目錄
科學家們現在擁有允許儲存感興趣基因和DNA序列的技術,透過使用cDNA和噬菌體。DNA目錄是一個用於記錄和儲存特定DNA樣本的過程。基本過程是取一個DNA樣本,將其連線到質粒上,將質粒插入細菌中,選擇感興趣的細菌,並將細菌儲存在大型冰箱中。
DNA樣本通常透過PCR從單個DNA鏈合成,該鏈包含三個部分:感興趣的基因、每端一個限制酶結合位點和一個“測試”基因。“測試”基因通常編碼一種色素或色素抑制劑,因此在後面的過程中,很容易檢測出哪些細菌具有感興趣的基因。
質粒是許多細菌細胞中天然存在的環狀DNA片段。質粒對科學家的有用特性是它們可以透過細菌膜吸收。一旦被吸收,細菌就會開始表達質粒上的基因。為了將感興趣的基因連線到質粒上,通常會使用人工合成的質粒。這種質粒將具有一定的抗生素抗性(通常是對氨苄青黴素的抗性)和一個特定的限制酶(與透過PCR擴增的DNA中使用的相同酶)。當質粒和感興趣的DNA混合時,質粒和DNA的許多“粘性末端”會連線起來。需要將DNA連線酶和ATP新增到溶液中,以將這些鏈共價連線在一起。
不幸的是,有時質粒可以簡單地重新連線到它斷裂的地方,這就是為什麼在感興趣的DNA序列中有一個測試基因的原因。我們將在(以後)知道哪些質粒有基因,哪些沒有。[1]
一旦質粒重新組裝在一起,它就可以插入細菌中。常用的方法是“熱休克”療法。(注意:細菌必須具有抵抗“熱休克”的能力,通常被稱為具有“熱休克”基因)熱休克細菌是指快速將細菌加熱到高於細菌當前溫度的溫度。雖然其機制尚不清楚,但其效果是,一些細菌會將質粒吸收到其細胞質中。
溶液中的一些細菌可能沒有吸收質粒,即使如此,一些細菌可能也吸收了“粘性末端”簡單地重新連線到自身的質粒。確定哪些細菌是我們想要的,哪些是我們不想要的方法是使用理想質粒上的測試基因和抗生素抗性基因。方法是在含有抗生素的瓊脂培養皿上培養細菌,這將殺死任何沒有某種形式的質粒的細菌。接下來是檢查哪些菌落表達了連線到質粒的感興趣DNA上的“測試基因”。在抗生素培養皿上存活並表現出“測試基因”的任何菌落都會被分離出來,並在它們自己的瓊脂培養皿中單獨培養。
最常用的儲存方法是使用大型冰箱,將感興趣的細菌在零下七十(70)攝氏度左右冷凍儲存。