結構生物化學/DNA重組技術

概述

在許多生物化學研究領域，獲取足夠數量的研究物質是一個挑戰。例如，從10 L培養的大腸桿菌中，最多隻能獲得7 mg的DNA聚合酶I，培養基中大腸桿菌的最高稀釋度約為10^10細胞*mL^-1，但仍然存在其他蛋白質，產量更低。DNA重組技術，也稱為基因工程和分子克隆，允許科學家操縱、複製和應用DNA進行研究。刪除、插入和替換是為合成新基因而實施的最有用的改變。此類技術通常包括克隆或擴增序列以供進一步研究。限制性內切酶和DNA連線酶在重組DNA的生產中起著至關重要的作用。聚合酶鏈式反應（PCR）常用於感興趣的序列，使其被核酸酶切割，然後被噬菌體、BAC或YAC克隆。使用DNA或RNA探針，可以從基因組文庫中克隆特定的基因。DNA重組技術的根本思想是將一段DNA片段插入到一個複製的DNA分子中，該分子也稱為克隆載體或運載體，因此DNA片段與載體一起復制。使用各種重組技術可以使科學家對DNA如何影響我們和其他生物體有新的理解。本節描述了基因工程中涉及的各種技術及其在生物化學中進行的許多實驗中的應用。

克隆載體

載體是可以用來將DNA序列插入細胞的DNA分子。載體用於複製。實驗室中常用的載體有質粒、病毒（λ噬菌體）和人工染色體。載體必須能夠被細胞複製。

基於質粒的克隆載體

質粒是雙鏈的，通常是環狀的。它們預先具有遺傳物質，如複製起點（DNA複製開始的地方），以便在細菌宿主或酵母中獨立複製。雖然質粒可能作為寄生蟲起作用，但它們在抗生素抗性等方面是有益的。

一方面，一些質粒在細胞中的數量為一到兩個，並且每個細胞分裂複製一次，並且已知處於嚴格控制之下。另一方面，大多數用於基因工程的質粒處於鬆弛控制之下，在細胞中可以存在少至10個多達700個質粒複製。此外，當蛋白質合成由於抗生素的抑制而停止時，細胞分裂也停止，這些質粒可以在細胞中複製多達3000個複製。從基因工程合成的質粒型別處於鬆弛控制之下，並且包含對抗生素有抗性的基因，同時攜帶內切酶位點。這些內切酶位點有助於插入需要複製的DNA。多克隆位點或多克隆位點是DNA的一小段，其中有一系列在質粒的其他任何地方都找不到的限制性位點。pUC18（“質粒通用克隆”）是大腸桿菌中常用的載體。以下連結提供了更多資訊和pUC18的示意圖。

1973年，Herbert Boyer和Stanley Cohen展示了DNA克隆中第一個基因混合質粒。當宿主細菌與質粒混合時，最佳條件是在施加二價陽離子（如鈣）和加熱至約42攝氏度時。這種條件使細胞膜更容易滲透DNA，並被稱為轉化感受態。一旦質粒載體被吸收，它就會永久地建立在細菌宿主中，效率僅為約0.1%。質粒載體無法用於複製超過一定大小的DNA，因為質粒複製所需的時間與質粒大小成正比。

基於病毒的克隆載體

另一種克隆更大尺寸DNA的方法是使用一種名為λ噬菌體的克隆載體。病毒基因組空間的中間三分之一可以被更大尺寸的DNA插入，因為該區域在噬菌體感染過程中不是必需的。體外方法可以透過噬菌體感染宿主細胞來幫助插入嵌合噬菌體DNA。利用噬菌體作為克隆載體具有以下優點：嵌合DNA可以大量製備並易於純化。此外，科學家可以利用λ噬菌體進行更長的DNA插入。允許病毒工具將DNA插入噬菌體頭部所需的唯一條件是在每端都有一個稱為cos位點的16-bp序列。這些末端需要至少相距36-51 kb，並且體外兩個cos位點的組合會產生cosmid載體。Cosmid沒有噬菌體基因，因此可以產生質粒。以下連結是一個λ噬菌體的卡通圖片及其重要特徵標籤。

M13-絲狀噬菌體是另一種克隆載體，它是在蛋白質管中呈單鏈和環狀的DNA。相同螺旋蛋白亞基的數量取決於被包被的噬菌體DNA的長度，但通常約為2700個亞基。當在非必需區域插入外源DNA時，會產生更長的噬菌體分子單元。儘管M13不能維持大於1kb的DNA插入片段，但噬菌體直接產生某些技術所需的單鏈DNA。此[[1]]展示了M13的外觀視覺化。

另一種基於病毒的克隆方法是桿狀病毒，它是一系列感染昆蟲但不感染脊椎動物的大型病原病毒，從而易於在實驗室中培養。與其他病毒一樣，形成病毒基因組的雙鏈DNA的一部分對於病毒複製並不重要，可以被外源DNA替換，最多可達15kb。此連結是桿狀病毒的電子顯微照片。

YAC和BAC載體

為了適應比cosmid攜帶的DNA片段更大的片段，使用了酵母人工染色體（YAC）和細菌人工染色體（BAC）。YAC包含酵母複製所需的所有分子必需品，例如複製起點、自主複製序列（ARS）、著絲粒和[[2]]。BAC在大腸桿菌中複製，並且來自通常複製長DNA片段的質粒。BAC載體具有自我複製、複製數控制和細胞分裂期間調控的質粒分離所需的最低限度的序列。以下連結是YAC圖和[圖]。

基因操作

在克隆DNA時，可以透過限制性內切酶獲取特定序列的片段。通常，限制性內切酶會在DNA雙鏈的特定位點切割，產生互補的單鏈末端。1972年，Janet Mertz和Ron Davis證明，限制性片段可以透過相同的限制性酶插入克隆載體中的切口。兩種DNA的互補末端在DNA連線酶的幫助下共價連線。DNA插入片段可以透過用相同的限制性酶切割克隆載體來提取，從而形成嵌合載體。

末端脫氧核苷酸轉移酶（TdT）是一種由Dale Kaiser和Paul Berg開發的技術，他們發現如果外源DNA和克隆載體沒有共同的限制性位點，它們也可以被連線，並且可以進行此過程。該酶將核苷酸新增到DNA鏈的3'-末端OH基團上，它是唯一已知的無需模板的DNA聚合酶。此外，克隆載體透過酶在特定位點切割，並且3'末端用poly(dA)尾巴延伸。最後，將同聚物尾巴加熱然後冷卻，並用DNA聚合酶I填充由於與另一條鏈差異而產生的任何間隙，然後DNA連線酶將兩者連線在一起。

與其他技術相比，基因操作去除了用於產生外源DNA插入的限制性位點。因此，很難從克隆載體中回收插入片段。然而，可以透過將與克隆載體的限制性位點匹配的化學合成的接頭與外源DNA的兩端連線來防止此問題。粘合是透過使用T4 DNA連線酶進行的，然後用限制性酶切割。可以檢視使用末端轉移酶拼接DNA的示意圖。

需要選擇轉化的細胞

由於轉化效率低和嵌合載體的構建困難，選擇被載體轉化的宿主細胞很困難。因此，在質粒轉化中，使用抗生素或產色底物的雙重篩選。例如，pUC18質粒包含lacZ'，因為lacZ'基因編碼β-半乳糖苷酶。該基因引發從β-D-半乳糖的糖O1到取代基的鍵的水解。因此，當在5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（簡稱X-gal）中生長並水解時，無色物質會變成藍色。可能出現兩種不同的情況：當大腸桿菌被未修飾的pUC18質粒轉化時，形成藍色菌落；當大腸桿菌被包含在外源DNA插入片段的pUC18質粒轉化時，由於插入片段與lacZ'基因的編碼序列衝突，則呈無色。新增氨苄青黴素可以排除在新增X-gal時通常會變成無色的細菌。這是因為有顏色的細菌的抗性基因amp^R完整。這些amp^R基因被稱為篩選標記。一些基因工程改造的λ噬菌體具有位於噬菌體基因組可用中心三分之一部分邊界的限制性位點，並且該片段可以透過DNA插入片段替換。無法獲得外源DNA的λ噬菌體太短，因此無法成為感染性噬菌體。特別是，由於在隨機缺失過程中丟失了DNA並且未恢復，因此cosmid可以支援更大DNA插入片段的構建。

質粒載體

質粒是存在於細菌中天然存在的環狀DNA片段。質粒可用作載體，透過將感興趣的DNA插入片段連線到質粒DNA中，從而整合和複製該DNA插入片段。透過用限制性酶（如EcoRI）處理載體，使其在特定位點切割並留下互補的單鏈“粘性末端”，從而製備接受DNA插入片段的載體。待插入的DNA片段用相同的限制性酶處理，使其具有與載體互補的末端。然後使用DNA連線酶將DNA插入片段連線到載體質粒中，從而導致重組。當細菌宿主菌落生長時，重組質粒DNA可以克隆和擴增。

重組DNA技術中使用的酶

1. II型限制性內切酶總是識別迴文序列，並且能夠切割DNA鏈。換句話說，它們斷裂DNA中特定鹼基序列的磷酸二酯鍵。
2. DNA連線酶與II型限制性內切酶相反，它將兩個DNA分子或片段連線在一起。
3. DNA聚合酶是一種能夠利用模板DNA並透過在3'末端新增核苷酸合成互補鏈的酶。
4. 逆轉錄酶是一種從RNA分子建立DNA的酶。逆轉錄酶與RNA聚合酶相反，RNA聚合酶從DNA生成RNA。
5. 多核苷酸激酶在多核苷酸的5'-OH末端新增磷酸基團。它可用於放射性標記DNA或允許連線。 6. Voet, Donald, Judith G. Voet. Biochemistry 3rd ed. 新澤西州：John Wiley & Sons, Inc, 2004. 列印版。