跳轉到內容

結構生物化學/DNA重組技術/噬菌體λ的歷史與研究

來自華夏公益教科書,開放的書籍,為開放的世界

觀察到其線性基因組在進入宿主細胞時透過互補鹼基配對形成一個環。基因組能夠以如此奇特的方式起作用,是因為存在稱為粘性末端(cos)的單鏈區域。這些cos位點能夠鹼基配對,這些位點的性質與由限制性內切酶產生的位點相同。(例如:EcoR1產生“粘性末端”。)這個環狀噬菌體DNA能夠透過附著位點與宿主細胞DNA重組。帶有某些細菌基因的噬菌體後代透過溶原途徑產生。使λ噬菌體非常有利的是,它可以破壞其宿主(裂解途徑)或成為其宿主的一部分(溶原途徑)。對這些替代迴圈控制的研究對我們理解基因轉錄調控非常重要。

λ噬菌體是一種病毒顆粒,由一個頭部組成,頭部由雙鏈線性DNA作為其遺傳物質,以及一條尾巴。它透過尾部將自身DNA注入宿主細胞,此時噬菌體將進入裂解或溶原途徑。λ噬菌體48kb的DNA中很大一部分對有效感染並不重要,可以被外源DNA取代,因此使λ噬菌體成為理想的載體。

λ噬菌體最初由Esther Lederberg於1950年從大腸桿菌中分離出來。它是一個被深入研究的生物體,並且一直是分子生物學中一個有用的工具。λ噬菌體可以用於重組DNA的克隆,使用其位點特異性重組酶(int)透過“Gateway”方法對克隆的DNA進行重排,以及在重組工程中。λ噬菌體的發現和研究導致了對轉導的理解,這為解釋進化模式提供了主要機制。

Allan Campbell在1962年研究了噬菌體λ,他研究了噬菌體的整合過程。他觀察到λ噬菌體有一個獨特的特徵,一些噬菌體會在某些大腸桿菌菌株中感染並繁殖,而其他菌株似乎具有免疫力。進一步探究這種情況發生的原因導致發現免疫菌株包含一個休眠的噬菌體複製,但休眠的複製可以被啟用。對噬菌體λ的研究為病毒生命週期、遺傳物質的調控和表達,以及遺傳物質的整合和切除機制提供了寶貴的貢獻。

突變λ噬菌體

[編輯 | 編輯原始碼]

突變噬菌體經過基因設計,使克隆更容易。其中一個特別有用的突變體稱為λ(gt)-(λ)(β),它只包含兩個EcoRI切割位點,而不是正常的五個。切割後,該噬菌體DNA的中間片段可以被去除,留下72%的正常基因組長度,這太短了,無法包裝成λ顆粒。因此,λDNA片段之間的適當長度的DNA插入物使重組DNA分子能夠被包裝。這些經過修飾的病毒比質粒更容易進入細菌。

基因組文庫

[編輯 | 編輯原始碼]

基因組文庫是一個大型的DNA片段集合。這些文庫有助於識別具有感興趣基因的DNA片段。建立基因組文庫利用λ噬菌體。首先,將總基因組DNA機械剪下,以產生隨機重疊的DNA片段群體,這些片段透過凝膠電泳分離。所有長度約為15kb的片段都被分離出來,並與合成接頭連線,以插入到λ噬菌體中,λ噬菌體複製自身,然後裂解其細菌宿主。產生的裂解液包含裝在病毒顆粒中的DNA片段,這些片段構成基因組文庫。

限制與修飾系統

[編輯 | 編輯原始碼]

限制:在一種細菌細胞中生長的噬菌體無法在其他細菌菌株中生長。在某些細菌菌株中觀察到λ噬菌體DNA的降解。後來發現這是限制性內切酶的結果,限制性內切酶會檢測到噬菌體DNA是外源的,然後切割它。因此,限制性內切酶被稱為限制性內切酶,因為它們能夠限制外源DNA。

修飾:對噬菌體進行修飾,使其能夠在其他細菌菌株中正常生長。修飾的一個例子是λ噬菌體DNA的甲基化,這樣它就不會被限制性內切酶切割。

參考文獻

[編輯 | 編輯原始碼]

Allison等,基礎分子生物學,2007。

華夏公益教科書