結構生物化學/DNA 重組技術/質粒/裂解途徑
在裂解途徑中,包含病毒 DNA 的 λ 噬菌體附著到細菌細胞上。然後將病毒 DNA 插入含有質粒 DNA 的宿主細胞。來自 λ 噬菌體的病毒 DNA 不會被引入質粒,而是保留在細胞中。來自 λ 噬菌體的病毒 DNA 利用宿主細胞的細胞機制快速複製病毒 DNA。然後,複製的病毒 DNA 被包裝到由病毒蛋白製成的病毒顆粒中。然後,病毒利用宿主細胞的機制和代謝來驅動病毒 DNA 包裝到蛋白質外殼中。在後代 λ DNA 複製幷包裹後,宿主細菌裂解或破裂並釋放大量 λ 噬菌體副本,以重複對其他宿主細胞的過程。
λ 噬菌體也是用於 DNA 克隆的載體。它是一種含有雙鏈噬菌體 DNA 的病毒,可以被引入大腸桿菌進行復制。已經建立了突變的 λ 噬菌體,使克隆更容易。一個例子是 λ-gt-λ-β 噬菌體。它包含兩個 EcoRI 限制性內切酶位點。噬菌體 DNA 的中間部分透過限制性消化被去除。剩餘的兩個 DNA 臂無法包裝成 λ 病毒體,因為它太小了。相反,外源片段的目標 DNA 與兩個臂一起用連線酶連線,它取代了被去除的中間部分。新增外源 DNA 使噬菌體 DNA 足夠長,可以包裝成病毒體。然後,包裝的 λ 病毒體可以被插入宿主細胞,然後透過裂解或溶源途徑被替換。
基因組文庫是指成千上萬個重組質粒克隆的完整集合,每個克隆都攜帶來自初始基因組的特定片段的副本。研究人員可以儲存這樣的文庫,並將其用作基因興趣的來源或用於基因組作圖。使用噬菌體構建的基因組文庫儲存在噬菌體克隆的集合中,無論使用何種克隆載體,限制性內切酶在切割基因組 DNA 時都不會尊重基因邊界,因此基因組文庫中的一些基因可能會被分成兩個或多個克隆。
λ 噬菌體也可用於容納基因組文庫。首先,透過酶消化將基因組 DNA 片段化。所需的片段約為 15 千鹼基對長,可以透過凝膠電泳分離。合成接頭連線到片段的末端。然後將片段引入突變的噬菌體 DNA 中,然後包裝成病毒體。將病毒體引入大腸桿菌宿主,然後產生許多噬菌體 DNA 的副本。然後,後代病毒體包含一個基因組文庫,其中包含已片段化的 DNA。可以篩選基因組文庫以分離特定的感興趣基因。
研究人員能夠使用互補 DNA (cDNA) 製備更有限型別的基因文庫。一旦他們能夠從細胞中分離出 mRNA,他們實際上就可以獲得細胞中所有從許多不同基因轉錄的 mRNA 分子的混合物。因此,製成的 cDNA 是基因集合的文庫。cDNA 僅代表細胞基因組的一部分——在起始細胞中轉錄的基因。
這種基因組文庫有其優勢,例如,如果研究人員想要研究負責特定型別細胞(例如肝臟或腦細胞)特定功能的基因,則更小、更具體的文庫允許以更詳細的方式進行此操作。此外,透過從同一生物體的相同型別細胞中在不同時間製造 cDNA,研究人員可以追蹤基因表達中發生的改變。
裂解噬菌體裂解生命週期共有六個階段。這六個階段是吸附、穿透、複製、成熟、釋放和再感染。
在裂解噬菌體生命週期的第一階段,噬菌體上的附著位點吸附在宿主細胞的受體位點上。噬菌體通常附著在細胞的細胞壁上,有時也會附著在細菌的鞭毛或菌毛上。
在第二階段,噬菌體具有特定的酶,該酶在細胞壁上打一個洞,然後將噬菌體的基因組插入細胞的細胞質中。將基因組插入細胞的另一種方法是製造一根進入細菌的空心管。這被稱為“收縮鞘”。
在第三階段,噬菌體的基因組插入細菌細胞後,細胞隨後會關閉 RNA、DNA 和蛋白質的合成。同時,噬菌體利用細胞的代謝成分製造噬菌體酶,從而複製自身的基因組。
在成熟階段,基因組緩慢地圍繞自身生成,為下一階段做準備。
當來自噬菌體基因組的溶菌酶分解肽聚糖時,就會發生釋放階段。這會導致細胞的滲透裂解,噬菌體被釋放到細胞外部。
這個被感染的細菌可能會產生大約 50 到 200 個噬菌體。因此,在噬菌體釋放後,它們可以去感染周圍的其他細菌細胞。
在 1960 年代初期,人們發現了一種含有 recA 基因的特殊 λ 轉導噬菌體,它對大腸桿菌細胞的同源重組至關重要,但該產物從未被分離出來。羅伯特·萊曼和他的團隊決定進行這項實驗。recA 蛋白具有依賴於單鏈 DNA 的 ATP 酶活性,這意味著它依賴於 DNA ATP 酶。RecA 蛋白可以促進復性(即變性的相反過程)的發生,該過程是互補的單鏈的,但它也可以促進 ATP 依賴性的單鏈與同源 DNA 雙鏈之間的鏈交換。它還可以形成 Holliday 連線,這是重組中的關鍵因素,其中 DNA 被重新排列以形成多樣性。Lehman, Robert. DNA 酶學家的漫遊:從 DNA 聚合酶到病毒潛伏。Annu. Rev. Biochem. 2006 年 1 月 16 日。