結構生物化學/DNA重組技術/質粒
質粒是細菌中自然存在的附屬染色體 DNA。一些細菌細胞可能沒有質粒，也可能有多個複製。它們可以獨立於宿主染色體複製。質粒是環狀的雙鏈 DNA。它們攜帶的基因很少，大小範圍從 1 到超過 200 千鹼基對。其基因的一些功能包括：提供抗生素抗性、產生毒素和分解天然產物。然而，質粒並不侷限於細菌；它們也存在於一些真核生物中（例如，粘菌屬紫色粘菌中的環狀核質粒）。
質粒是一種環狀雙鏈 DNA，通常存在於細菌中（但它確實存在於真核生物和原核生物中）。它可以自行復制（無需染色體 DNA 的幫助），並且經常用於重組 DNA 研究以複製感興趣的基因。一些質粒可以植入細菌或動物染色體中，在那裡它成為細胞基因組的一部分，然後將感興趣的基因揭示為表型。這就是今天進行許多基因識別研究的方式。
質粒包含三個組成部分：複製起點、用於克隆感興趣基因的多克隆位點（稱為限制酶切割的多個克隆位點）和抗生素抗性基因（可選擇標記）。
質粒在用於重組技術之前通常會被分離出來。鹼性裂解是分離環狀質粒 DNA 的首選方法。此過程快速可靠。首先獲得具有感興趣質粒的細胞，並用鹼裂解它。然後，這一步接著提取質粒。使用 SDS 和醋酸鉀沉澱細胞碎片。將這部分離心，並去除沉澱物（細胞/細胞碎片）。接下來，使用異丙醇從上清液中沉澱質粒 DNA。然後將質粒懸浮在緩衝液中。鹼性裂解可以根據是微量、中量或大量製備，得到不同數量的質粒。
質粒可能與病毒有關，因為由於它們能夠在其宿主內部自我複製，因此它們可以是獨立的生命形式。儘管它們可能被視為獨立的生命形式，但它們對宿主的依賴性很高。質粒及其宿主往往具有共生關係。質粒可以為其宿主提供必需的 DNA 包裹，攜帶可在艱難時期導致相互生存的基因。透過為其宿主提供這種遺傳資訊，質粒使宿主得以生存，同時使自己能夠在宿主中生存幾代。
質粒用作載體，在細菌中克隆 DNA。用於 DNA 克隆的質粒的一個例子稱為 pBR322 質粒。pBR322 質粒包含一個基因，使細菌能夠抵抗四環素和氨苄青黴素。為了使用 pBR322 質粒克隆基因，首先使用限制性內切酶在限制性位點切割質粒。pBR322 質粒包含三個限制性位點：PstI、SalI 和 EcoRI。前兩個限制性位點分別位於編碼氨苄青黴素和四環素抗性的基因內。在任一限制性位點切割將使它們各自的基因和抗生素抗性失活。靶 DNA 用與限制性位點相同的限制性內切酶切割。然後使用 DNA 連線酶將靶 DNA 退火到質粒。靶 DNA 被整合到質粒後，宿主細胞在含有氨苄青黴素或四環素的環境中生長，具體取決於哪個基因保持活性。一旦宿主能夠複製，就會產生許多複製的靶 DNA。
另一種用作克隆 DNA 載體的質粒稱為 pUC18 質粒。該質粒包含一個基因，使宿主細胞對氨苄青黴素具有抗性。它還包含一個基因，使其能夠產生β-半乳糖苷酶，β-半乳糖苷酶是一種降解某些糖的酶。當暴露於特定的底物類似物時，該酶會產生藍色色素。這使得宿主易於識別。β-半乳糖苷酶基因包含一個多克隆位點區域，該區域包含多個限制性位點。pUC18 質粒可以被幾種不同的限制性內切酶切割，這提供了更大的通用性。當多克隆位點序列被切割並引入目標 DNA 並連線起來時，這會使編碼β-半乳糖苷酶的基因失活，並且該酶將不會被產生。當暴露於底物類似物時，宿主細胞不會產生藍色色素。這使得重組細胞易於識別和分離。
克隆是一種重組基因的方法，以利用細菌的天然能力來重新建立質粒。工程質粒可用於克隆長達 10,000 個鹼基對的遺傳物質，遺傳物質的數量受質粒大小的限制。由於細菌質粒中表達基因的重複，可以去除質粒的重複遺傳物質並用所需性狀替換它。大多數用於實驗室使用的預先設計的質粒已經包含抗生素抗性基因、多克隆位點和複製起點。多克隆位點經過設計，允許多個獨特的切割位點，這些切割位點將允許所需的 DNA 片段化。複製起點將模擬將用於克隆的細菌的遺傳物質。
獲得質粒後，將使用特定的核酸內切酶在多克隆位點上切割兩個位點。然後，所需的 DNA 也將使用不同的核酸內切酶從不同的來源切割。切割的 DNA 有時會用聚合酶鏈式反應擴增。所需的 DNA 性狀將被插入現在為空的多克隆位點。用所需的遺傳性狀替換多克隆位點稱為盒式誘變。新建立的質粒將與細菌混合，然後對細菌進行熱休克或電休克，以幫助質粒作為載體發揮作用。在允許細菌繁殖後，將提供工程質粒賦予抗性的抗生素。所有仍然存活的細菌都將獲得插入的 DNA 和抗生素免疫力的所需性狀。可以使用不同的方法收集插入 DNA 的新蛋白質或生化結構。
缺失發生在從 DNA 序列中刪除一個或多個鹼基對時。可以使用不同的限制性內切酶來切割出某個片段，然後使用 DNA 連線酶連線以重新形成新的、更小的質粒，從而可以從質粒中去除大量的 DNA。可以使用在粘性末端附近切割的多個限制性內切酶，然後連線，從而去除單個或少數鹼基對。
替換是蛋白質序列中單個氨基酸發生改變的結果。這通常是透過改變遺傳密碼序列上的一個（點突變）或多個鹼基對來實現的，以改變特定位點的氨基酸，被稱為寡核苷酸定向誘變。寡核苷酸的設計使得在特定位點只有一個鹼基對不同，並且這個不同的鹼基對將編碼新的殘基。將寡核苷酸退火到質粒上，質粒充當 DNA 模板，使用 DNA 聚合酶複製導致包含該突變的鏈。複製的雙螺旋 DNA 的一條鏈將是親本鏈，包含原始（野生型）鹼基序列，而另一條鏈將包含包含編碼所需新蛋白質的新（突變體）DNA 鏈。透過表達突變鏈，可以收穫所需的蛋白質。
插入發生在將整個 DNA 片段引入質粒時。該 DNA 片段被稱為盒式，該技術被稱為盒式誘變。使用限制性內切酶切割質粒，去除一部分 DNA。然後將特異性合成的或收穫的 DNA 連線到該區域，並表達和研究質粒。
還可以透過將原本無關的基因連線在一起，來建立全新的蛋白質和基因。
分類方式
質粒對於宿主細胞的生存並非必需。它們攜帶能夠為宿主提供選擇性優勢的基因，例如對其他生物體產生的天然抗生素的抗性。質粒產生的抗生素抗性基因將允許宿主細菌在存在產生這些抗生素的競爭性細菌的情況下生長。對質粒進行分類的一種方法是根據它們轉移到其他細菌的能力。接合質粒保留 tra 基因，這些基因執行復雜的接合過程，即質粒向另一個細菌的轉移。相反，非接合質粒無法啟動接合，因此只能透過接合質粒轉移。一類過渡性質粒被認為是可動員的，它們只包含成功轉移所需基因的一個子集。它們有能力透過在質粒存在的情況下以高頻率轉移來寄生接合質粒。目前，質粒被用來操縱 DNA，並且可能被用作治療疾病的工具。
Figure 1-1: Illustrates the process of bacterial conjugation.
一個細胞中可能存在多種質粒。在一個大腸桿菌中已經發現最多有七種不同的質粒共存。也可能發現不相容的同類質粒，由於重要質粒功能的調節，這些質粒中只有一種在細胞環境中存活。因此，質粒可以根據相容性被劃分為不同的組。
按功能分類質粒另一種對質粒進行分類的方法是根據它們的功能。
總共有五個主要亞組。
生育質粒（F 質粒）- 攜帶接合的生育基因（tra 基因），即兩個細胞之間遺傳資訊的傳遞。F 質粒也被稱為附加體，因為它們整合到宿主染色體中並促進染色體 DNA 在細菌細胞中的轉移。
Figure 1-2: Illustrates a fertility plasmid.
抗性質粒（R 質粒）- 包含編碼對抗生素或毒素的抗性的基因。在 Berg 的 "生物化學" 第 5 章中發現的 R 質粒的例子包括以下內容。
pBR322 質粒pBR322 是最早用於克隆目的的質粒之一。它包含對四環素和氨苄青黴素的抗性基因。在特定限制位點插入 DNA 可以使四環素（稱為插入失活效應）或氨苄青黴素抗性基因失活。
圖 1-3：說明 pBR322 R 質粒
pUC18 質粒pUC18/pUC19 與 pBR322 相比具有更高的多功能性。與 pBR322 相似，pUC18 質粒具有複製起點和基於氨苄青黴素抗性的選擇標記。此外，該質粒還包含一個 β-半乳糖苷酶基因，這種酶可以降解某些糖。在存在特定底物類似物的情況下，這種酶會產生藍色色素，可以很容易地檢測到。此外，該酶已被改造，因此它具有一個多克隆位點區域，在那裡可以使用許多不同的限制酶或酶組合在不同的位置切割。為可以克隆的 DNA 片段創造更多樣的可能性。有趣的是，DNA 片段的插入會使 β-半乳糖苷酶失活。因此，如果藍色的色素沒有生成，則表明 DNA 片段沒有正確插入。pUC18 與 pUC19 相似，但 MCS 區域是反向的。
圖 1-4：說明 pUC19 R 質粒
腫瘤誘導質粒（Ti 質粒 "毒力質粒"）- 包含農桿菌，它們攜帶細菌透過轉變為腫瘤狀態併合成冠癭鹼、毒素和其他毒力因子而成為病原體的指令。質粒有效地將外源基因轉移到某些植物細胞中。Ti 質粒也可以在 Berg 的 "生物化學" 第 5 章中找到。
圖 1-5：說明 Ti 質粒
降解質粒- （分解代謝質粒）一種能夠使宿主細菌代謝通常難以或不尋常的有機化合物（例如殺蟲劑）的質粒。
Col 質粒- 包含編碼抗菌多肽（稱為細菌素）的基因，細菌素是一種殺死其他菌株細菌的蛋白質。大腸桿菌的 Col 蛋白由 Col E1 等蛋白質編碼。
質粒可能屬於上述質粒亞組中的多個亞組。
那些僅作為細菌中一個或幾個複製存在的質粒，在細胞分裂過程中面臨著被丟失到一個分離細菌中的風險。那些單複製質粒實施了積極嘗試將一個複製分配到兩個子細胞的系統。
一些質粒包括成癮系統，例如大腸桿菌中質粒 R1 的宿主殺傷（hok）系統。產生壽命較長的毒物和壽命較短的解毒劑。那些保留質粒複製的子細胞存活下來，而那些沒有繼承質粒的子細胞則會死亡或由於來自親本細胞的揮之不去的毒物而生長速率下降。
質粒也自主複製。每個質粒都包含自己的 DNA 複製起始序列，但只有複製所需基因的一部分。一些質粒配備了自我保護基因，它們被稱為成癮模組。成癮模組也迫使宿主細胞要麼保留質粒，要麼死亡。
Berg, Jeremy M. 等人。"生物化學"。第 6 版。W.H. Freeman and Company，紐約，2007 年。
質粒作為載體具有獨特的特性，在基因工程中提供了一種通用的工具。質粒被用來透過將新基因引入受體細胞來建立轉基因生物。例如，來自土壤細菌農桿菌的 Ti 質粒在植物病理學中非常有價值，用於培育對疾病（例如葉片上的黑穗病和冠癭瘤）具有抗性的植物。
質粒由於其在抗生素合成中的作用，也具有醫學意義。鏈黴菌屬中的土壤細菌可以產生數千種抗生素，例如鏈黴菌屬中的鏈黴菌屬和鏈黴菌屬。在另一個例子中，大腸桿菌質粒被用來克隆青黴素 G 醯化酶的基因，這種酶可以將青黴素 G 轉化為抗菌的 6-氨基青黴烷酸。[1] 再次，這些克隆過程是在 II 型限制酶的幫助下進行的，以將目標基因插入到質粒載體中。
在 DNA 重組技術中，基於質粒的報告基因至關重要，因為它們允許即時觀察生物體。綠色熒光蛋白的基因可以整合到正在研究的生物體的質粒中。編碼的蛋白質很小，不會改變宿主蛋白質的功能。GFP 的這一特性使其非常容易觀察細胞動力學。[2]
這些只是多年來開發的質粒的眾多技術、應用和用途中的幾個例子。隨著更多例子和機遇的出現，質粒工程的未來看起來非常光明。
為了從細菌細胞中純化質粒 DNA，需要進行鹼性裂解質粒製備。將按照以下步驟製備三種溶液。
溶液 1：50mM 葡萄糖、25mM Tris-HCl pH8、10mM EDTA、50 微克/毫升 RNase
新增葡萄糖的目的是增加細胞外的溶質濃度，因此，一旦細胞破裂，滲透壓將使水從細胞中流出，並帶走質粒。EDTA 是二價陽離子（如 Mg2+、Ca2+ 和 Mn2+）的螯合劑。這些陽離子會被結合並從溶液中去除。Mg2+ 是 DNase 的輔因子，因此如果它被結合起來，DNase 將無法消化 DNA，因此 DNA 將保持完整。RNase A 將降解任何存在的細菌 RNA。
溶液 2：0.2M NaOH、1%SDS
SDS 透過溶解細胞膜來裂解細胞。NaOH 產生的高 pH 值將使細菌蛋白質變性，因此它們會從溶液中沉澱出來。極端的 pH 值將使 DNA 變性，使雙螺旋的兩個鏈分離，從而產生細菌染色體和質粒 DNA 的單鏈。但是，小的互鎖質粒鏈會保持在一起，因為它們緊密結合，因此 NaOH 無法進入。
溶液 3：3M 醋酸鉀（29.4g KOAc + 11.5 毫升冰醋酸/ 100 毫升），pH 5.5
醋酸緩衝液將使溶液的 pH 值恢復到更接近中性的 pH 值。這將允許 DNA 鏈重新退火。染色體 DNA 太複雜太大，無法在這些條件下重新退火，因此只有質粒 DNA 重新退火。K+ 離子將與 SDS (-) 結合形成 KDS，KDS 會從溶液中沉澱出來。
Slonczewski, Joan L. 微生物學。"不斷發展的科學"。第二版。