結構生物化學/DNA重組技術/限制性內切酶
限制性酶最初由 Werner Arber 和 Hamilton Smith 發現。Daniel Nathans 開創了它們的應用，這導致了重組 DNA 技術的出現。
限制性內切酶，也稱為限制性酶，負責細菌中稱為宿主控制限制修飾或表型修飾的現象。限制/修飾酶系統分為三類：I 型、II 型和 III 型。這些系統之間的主要區別在於 II 型酶包含獨立的限制和甲基化系統，而 I 型和 III 型酶在一個酶中同時具有限制和甲基化特性，由兩個或三個異源亞基組成。分子生物學中常用的商業限制性酶是由 II 型系統產生的。II 型限制性內切酶識別特定的迴文序列（在兩條鏈上讀起來都一樣，除了其中一條鏈是反向的）。限制性酶識別特定鹼基對序列（大約 4-8 個鹼基對長），並具有旋轉對稱軸。一旦建立了這個識別位點，它就會切斷雙螺旋 DNA 每條鏈上的磷酸二酯鍵。產生的片段數量和大小取決於待切割 DNA 中識別位點的出現頻率。限制性內切酶將 DNA 切割成更小的片段，以便更容易地分析和操作。限制性內切酶可以幫助分析染色體結構、對長 DNA 分子進行測序、分離基因以及建立新的待克隆的 DNA 分子。
限制性酶的切割可以產生多種不同的末端。通常，這些末端具有 3'-羥基和 5'-磷酸基末端。一些切割產生單鏈突出端，稱為粘性末端或粘性末端，而另一些則產生平末端。這些末端或切割位點隨後可以退火併連線到載體 DNA 或任何具有相容末端的 DNA。並非所有切割都一定是對稱的，例如 BamHI，它以非對稱的方式從 DNA 序列的兩端切割。
也可以透過凝膠電泳觀察限制性片段。可以使用三種不同的方法。第一種方法是聚丙烯醯胺凝膠，它可以分離高達 1000 個鹼基對的片段。下一個是瓊脂糖凝膠，它可以分離高達 20kb 的片段。最後，脈衝場凝膠電泳 (PFGE) 可以分離高達數百萬個核苷酸，這取決於電場開啟和關閉時 DNA 的拉伸和鬆弛。然後可以使用放射自顯影或溴化乙錠染色來觀察 DNA。凝膠電泳透過電場執行，根據大小分離片段，注意較小的片段在凝膠中移動得更遠，而較大的片段更靠近起點。與已知大小的標準相比，限制性酶切割的位置是已知的。
示例
假設以下 DNA 片段被限制性酶識別。紅色 (*) 符號表示對稱軸。這些切割位點的一個主要組成部分是在此軸周圍存在二重旋轉對稱。切割位點也在圖中突出顯示。一旦建立了這個位點識別，限制性酶就會在雙螺旋的對應鏈上切割突出顯示的 C-G 和 G-C 之間的磷酸二酯鍵。請注意，不同的限制性酶具有不同的切割位點。因此，磷酸二酯鍵的切割並不總是發生在 C-G 或 G-C 之間。
- 5' C-C-G-C-G-G 3'
- *
- 3' G-G-C-G-C-C 5'
- 5' C-C-G-C-G-G 3'
BamHI 是限制性酶的一個例子。它切割回文序列，每次 6 個鹼基。例如
此影像顯示了 BamHI 在哪裡切割回文序列。
BamHI 結合非特異性 DNA，並透過一個二聚體酶沿著 DNA 鏈滑動，該酶快速讀取 DNA 以查詢 6 個鹼基的迴文序列。如果它發現 6 個不是迴文的鹼基，它仍然會切割鹼基，但切割效果不好。BamHI 在找到迴文序列進行切割時工作效果最佳。
檔案：催化機制.jpg 此影像顯示了 BamHI 用於切割磷酸二酯鍵的機制。在第一步中，當與水反應時，底物獲得一個羥基並使磷酸鹽帶上兩個負電荷。金屬通常處於過渡態，因為金屬是正電荷，它平衡了兩個負電荷，並使過渡態更穩定。鎂是一種使用良好的金屬。鈣有時也被使用，但效果不佳，因為它會阻礙切割過程。然後將水新增到過渡態中，這導致質子捐贈給離去基團，最終斷裂鍵並切割 DNA。
除了磷酸二酯鍵現在斷裂，切割 DNA 外，反應前和反應後狀態中的所有內容基本上保持相同，如下面的圖片所示。
限制性內切酶由於兩個主要特徵而表現出其高度特異性。一個是被切割的限制性酶識別序列，不能降解宿主 DNA。第二，它們必須只切割被特異性識別的位點。限制性內切酶必須能夠區分一個特定的切割序列和另一個序列。限制性內切酶能夠透過甲基化過程表現出這些特性。存在於生物體中的甲基化酶保護包含被限制性酶識別的序列的生物體 DNA 免受切割。一旦甲基化酶將生物體自身鹼基中的腺嘌呤甲基化，限制性酶就不會在這些位點切割。每種限制性內切酶都會導致宿主細胞中產生一種特定的甲基化酶，它會將宿主 DNA 中的特定序列位點甲基化。這種自我甲基化和限制性酶作用的系統被稱為限制-修飾系統。宿主生物體產生的限制性內切酶只能切割沒有被甲基化腺嘌呤標記的序列，從而實現限制性酶控制。
切割機制
如上所述，限制性內切酶切割氧 3' 和磷原子之間的鍵。限制性內切酶催化 DNA 中這些磷酸二酯鍵的水解。該反應的機制基於親核進攻磷，產生五配位過渡態。這會導致雙錐形結構。
I 型 I 型限制性酶是最先被發現的，它們是兩種不同的大腸桿菌菌株的特徵。識別位點是非對稱的，由兩部分組成：一部分包含 3-4 個核苷酸，另一部分包含 4-5 個核苷酸，這兩部分由間隔區隔開。它們的活性需要幾種酶輔助因子。I 型限制性酶具有三個亞基，稱為 HsdR、HsdM 和 HsdS；HsdR 對於限制是必需的，HsdM 對於向宿主 DNA 新增甲基是必需的（甲基轉移酶活性），HsdS 對於切割位點識別的特異性以及甲基轉移酶活性很重要。
II 型 典型的 II 型限制性酶在幾個方面不同於 I 型限制性酶。它們只由一個亞基組成，它們的識別位點通常是完整的且是迴文序列，長度為 4-8 個核苷酸，它們在同一個位點識別和切割 DNA，並且它們在活性中不使用輔助因子（除了 Mg2+）。這些是最常獲得和使用的限制性酶。
III 型 III 型限制性酶識別兩個獨立的反向排列的非迴文序列。它們在識別位點之後大約 20-30 個鹼基對處切割 DNA。
在對質粒DNA進行限制性酶切後，DNA片段在瓊脂糖凝膠上進行分析。透過觀察凝膠上得到的條帶模式，可以確定DNA和載體的尺寸。這可以用來確認是否分離出正確的質粒。
從上面的圖中可以得出以下結論：
第3和第6泳道用酶進行了兩次消化。兩條帶代表兩段線性DNA。較低的條帶是基因插入多克隆位點中兩個酶切位點之間的大小，另一個條帶是質粒其餘部分的大小。
第4和第7泳道用酶進行了一次消化。條帶移動速度比其他線性DNA慢，表明DNA被切開。這個DNA解旋，但仍然是環狀的，通常比相同大小的線性DNA移動得更慢。
第5和第8泳道未進行消化。超螺旋DNA比相同大小的線性DNA移動得更快。