結構生物化學/DNA重組技術/DNA測序
DNA測序 確定DNA分子中腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶的順序。DNA測序可以瞭解各種各樣的遺傳資訊。在DNA操作方面，它是最簡單的技術之一。
關於DNA測序：限制性內切酶導致了重組DNA。細菌會產生限制性內切酶，這種酶會根據特定的短鹼基序列切割DNA。在自然界中，限制性內切酶可以保護細菌免受病毒的異源DNA侵害。在試管中，純化的限制性內切酶被用於“切割和貼上”來自兩種無關生物的DNA，從而產生重組DNA。“基因克隆”構建的人工重組DNA最終使得利用從細菌轉化自然現象中獲得的過程，在幾乎所有型別的生物體基因組之間轉移基因成為可能。
第一個成功的測序方法被稱為桑格測序，以其發明者弗雷德里克·桑格命名。這種方法是革命性的，開闢了無數的研究途徑。然而，它在時間、成本和材料方面仍然是低效的。噬菌體fX174是一種只有5368個鹼基對的病毒，是第一個在1978年被測序的，之後還有很多其他病毒被測序。然後，在1983年，PCR方法被開發出來，可以擴增特定的DNA片段。後來，在1986年，CIT的勒羅伊·E·胡德實驗室和史密斯宣佈了第一臺半自動DNA測序機。接下來，鳥槍法由克雷格·文特爾在199年建立。這種方法可以更快地進行測序。
另一種測序方法是熒光檢測。在這種方法中，熒光標籤用於標記每個不同的雙脫氧類似物。然後進行電泳，分離的DNA條帶穿過。鹼基被標記為不同的顏色，使其身份明顯，序列很容易確定。
也許最大的提議是在1990年，當時人類基因組計劃被提議並啟動，旨在編目整個人類基因組。後來，由克雷格·文特爾領導和建立的團隊在TIGR的設施中對最大的細菌進行了測序，總共1.8 Mb。之所以能夠實現這樣的壯舉，是因為計算軟體的改進，這些軟體被建立來處理鳥槍法建立的極其龐大的資料集。他們不是一次對基因組的極小片段進行鳥槍法測序，而是對整個基因組一次性進行測序。然後TIRG組裝器（軟體名稱）將24,000個鹼基對識別為一個完整的基因組。這種新的測序方法將所需的成本和時間幾乎減少了一半。人類基因組計劃的開放獲取政策允許任何學術機構使用所有收集的資料，並幫助改變了我們對基因組的工作知識。然而，克雷格·文特爾的專案Celera最初拒絕公佈其資料，直到他被迫這樣做。該小組現在仍然是該行業最有影響力的領導者之一。在2003年底，除了少數幾個空白外，整個人類基因組被宣佈完成，預示著科學新時代的到來。
測序DNA 可以透過應用化學或酶促方法來闡明。基本酶促方法是基於DNA聚合酶的能力，即延伸與待測序的單鏈DNA雜交的引物，直到摻入鏈終止雙脫氧核糖核苷三磷酸(ddNTP)。ddNTP在碳3'缺少一個羥基，下一個dNTP的生長DNA鏈會新增到該位置。ddNTP用作鏈終止劑，因為在碳3'沒有羥基的情況下，就不能再新增任何核苷酸，DNA聚合酶會脫落；DNA鏈在標記的G、A、T或C處停止。得到的片段具有共同的起源，但在不同的核苷酸處終止，導致長度混合的DNA鏈。每個片段被標記，每個雙脫氧類似物（終止劑）被標記為不同的熒光顏色。它們透過使用高解析度凝膠電泳進行分離，這種方法根據它們的不同大小進行分離；較短的鏈在凝膠中移動得更快。一旦鏈穿過凝膠，它們的身份可以透過熒光測量來檢測（取決於它們的顏色）。描述的以下技術在許多不同的方法中使用，並被認為是常識。
放射自顯影的替代方法是“熒光檢測”。作為標籤使用的熒光蛋白存在於許多腔腸動物（如珊瑚和水母）的發光和產色細胞中。在熒光標籤連線到每個雙脫氧類似物後，不同的鏈終止劑具有不同的顏色。熒光是指光被分子吸收並以更長波長重新發射（有時會落入可見光範圍，因此人類的眼睛可以看到），產生特定的顏色。當它被光激發時，熒光會在沒有能量輸入（如ATP或任何其他輔因子）的情況下發出熒光。然後，透過終止劑的混合物，反應可以分別進行，並且片段的混合物可以透過凝膠電泳分離。DNA條帶可以透過它們的顏色來檢測，因為它們會出現。例如，如果所有腺嘌呤雙脫氧類似物都被標記為綠色標籤，並且比引物長5個鹼基的片段呈綠色，則已知引物後第五個鹼基是腺嘌呤。這種方法使我們能夠找到具有多達500個鹼基的多核苷酸的序列。這是一個可行且有競爭力的解決方案，因為它消除了放射性成分的使用，並且可以自動化。因此，每天可以測序超過100萬個鹼基。
熒光檢測器可能是現有現代HPLC檢測器中最靈敏的。即使在流通池中存在單個分析物分子，也可以檢測到。通常，熒光靈敏度對於強紫外線吸收材料而言，比紫外線檢測器高10-1000倍。熒光檢測器在其他光學檢測器中非常特異和選擇性。這通常被用作在樣品中測量特定熒光物質的優勢。當具有特定官能團的化合物被更短波長能量激發併發射更高波長輻射時，這種輻射被稱為熒光。通常，發射是在與激發成直角的方向上測量的。
大約 15% 的化合物具有天然熒光。共軛 π 電子，尤其是芳香族成分中的共軛 π 電子，會產生最強的熒光活性。此外，具有羰基的脂肪族和脂環族化合物以及具有高度共軛雙鍵的化合物也會發光，但通常程度較低。大多數未取代的芳香烴都會發出熒光，量子產率隨著環數、縮合度和結構剛性的增加而增加。熒光強度取決於激發和發射波長，允許選擇性地檢測某些成分，同時抑制其他成分的發射。任何成分的檢測都很大程度上取決於所選波長，如果一個成分可以在 280 ex 和 340 em. 處被檢測到，則另一個成分可能會被漏掉。大多數現代探測器允許快速切換激發和發射波長，這提供了檢測混合物中所有成分的可能性。例如，在非常重要的多環芳烴色譜圖中，前 6 個成分的激發和發射波長分別為 280 和 340 奈米，然後更改為 305 和 430 奈米的相應值；後者的值代表了允許靈敏檢測化合物的最佳折衷方案。
熒光蛋白
[edit | edit source]熒光蛋白是我們用於熒光檢測以標記 DNA 的工具。在熒光蛋白中，熒光團通常是由三個氨基酸形成的雙環結構。它被稱為β桶，因為它是由 11 條β摺疊片組成，並在頂部和底部有額外的氨基酸序列閉合。它們通常可以附著到其他蛋白質而不改變其他蛋白質的結構或功能。因此，它經常被用於實驗室標記和檢測分子、細胞和生物體。它也被用於藥物篩選、評估用於人類基因治療的病毒載體、監測環境中基因修飾的微生物以及生物防治。
綠色熒光蛋白 (GFP) 在一種名為維多利亞多管水母 (Aequorea victoria) 的水母物種中存在了超過一億六千萬年。這種蛋白質存在於維多利亞多管水母的光器官中。GFP 不是水母照片中經常看到的輝光的來源——那種“熒光”實際上是由於用於拍攝水母的閃光反射造成的。
由於熒光蛋白獨特的β桶摺疊，整個蛋白質中殘基的突變有可能顯著改變其熒光特性。正如海報中所強調的那樣，這種突變最顯著的結果是目前可用的各種不同發射顏色，這大大提高了這些蛋白質作為分子探針的用途。然而，大多數單點突變對 FP β桶的緊密堆積有負面影響，因此導致環境敏感性增強和亮度降低。雖然一些缺陷可以透過額外的突變來彌補，但衍生的 FP 與原始蛋白質相比，通常亮度較低和/或對環境更敏感。這種現象在尋找四聚體紅色熒光蛋白的真正單體版本的過程中尤為明顯，該蛋白質來自珊瑚 Discosoma sp。
測序方法
[edit | edit source]隨著時間的推移，已經開發出大量測序方法，下面列出了其中一些方法及其簡要描述。
焦磷酸測序
[edit | edit source]焦磷酸測序是由 Pål Nyrén 和 Mostafa Ronaghi 於 1996 年在斯德哥爾摩皇家理工學院開發的。測序過程是透過酶促合成 DNA 的互補單鏈來完成的。鹼基 A、T、G 和 C 在過程中依次新增和移除。當 DNA 聚合酶新增到單鏈中時，ATP 硫酸酶會產生 ATP，ATP 硫酸酶被熒光素酶用於產生光。然後檢測並記錄該鹼基的光強度。如果添加了一個鹼基但沒有產生光，則添加了錯誤的鹼基來進一步進行測序。該過程重複多次，直到 DNA 的整個鏈被完全合成和測序。
桑格測序
[edit | edit source]桑格測序方法誕生於 1974 年，其最基本原理是使用鏈終止劑，以與該位點模板互補的引物為起點，延伸 DNA 模板的特定位點。該方法使用放射自顯影，使用 DNA 聚合酶、四個 DNA 鹼基、引物和鏈終止核苷酸，導致產生不同大小的 DNA 片段；其大小取決於使用該特定核苷酸的位置。使用聚丙烯醯胺凝膠電泳 (PAGE) 根據片段大小對片段進行分離。一種更簡單的方法是使用熒光染料終止劑測序，其中必須使用熒光染料標記鏈終止劑。每個鏈終止劑用不同的彩色染料標記。進行 PAGE，並在一次反應後識別所有鏈終止劑，而不是之前提到的標記引物方法中所需的四次反應。然而，桑格 DNA 測序方法存在一些問題，因為凝膠製備需要大量時間和人工，而且需要大量樣品。在測序之前，必須將 DNA 變性為單鏈，並且必須將引物連線到模板鏈上，模板鏈以其 3' 端位於所需 DNA 片段的旁邊建立。它們透過放射性 (放射自顯影) 或熒光進行標記。然後將溶液分成 4 個容器，然後在其中新增四種試劑中的一種：ddAPT、ddTPT、ddCTP、DDGTP，以及 DNA 聚合酶和所有四個 dNTP。該方法之所以有效，是因為所有反應都從同一個核苷酸開始，並以所需的鹼基結束。因此，新鏈會在每個可以新增核苷酸的位置終止，從而產生不同長度的條帶。在此之後，DNA 再次變性並透過電泳進行分離，然後將分組容器中的內容物在聚丙烯醯胺凝膠上進行分離，以將條帶彼此分離。
由於大型片段難以測序，因此有必要使用小片段進行工作。**弗雷德里克·桑格**設計了一種控制複製終止的方法。在這項極其簡單的技術中，使用 2',3'-脫氧核苷酸類似物來啟動鏈終止。每個反應管都包含 A、G、T 和 C 脫氧核苷酸類似物以及常規放射性標記的 dNTP。在控制複製終止後，將每個反應組在一個電泳凝膠的單個泳道中進行。由於複製在隨機摻入脫氧核苷酸類似物後終止，因此最短的片段（執行距離最遠）是序列中的第一組鹼基。
DNA 分析的未來
[edit | edit source]基因組測序將極大地促進我們對遺傳生物學的理解，並在醫學診斷和治療方面具有巨大潛力。一個障礙是基因組測序的成本（第一個人類基因組圖譜是在 2003 年繪製的，據估計花費了 30 億美元）。奈米孔裝置可能會將此成本降低到幾百美元，從而使個人基因組測序對每個人都可用。在 1990 年代中期，來自加州大學聖克魯茲分校的戴維·迪默設想了將 DNA 穿過一個微小孔 (奈米孔) 的想法。
奈米孔是一個微小的孔，DNA 分子可以穿過並被讀取。目前，奈米孔 DNA 分析方法涉及將蛋白質插入脂質膜中。當施加電壓時，DNA 分子可以被拖過奈米孔。這種方法的主要缺點是脂質膜非常脆弱。
來自代爾夫特理工大學和牛津大學的研究人員提出了一種新的方法，該方法結合了人工和生物材料，在晶片上建立奈米孔，可以分析單個 DNA 分子。該方法涉及將單個蛋白質連線到較大的 DNA 片段上，然後將其穿過矽氮化物膜上的預製開口。
然而，矽氮化物材料有點太厚，因此一個以上的核苷酸可能同時進入孔中。來自代爾夫特、賓夕法尼亞和哈佛大學的研究人員正在使用石墨烯（單原子厚度的碳片），並已將 DNA 穿過鑽入石墨烯的奈米孔。石墨烯可能是基因組測序的未來，因為它堅固、薄且具有良好的導電性。
單分子測序是一種快速、低成本的直接測序DNA或RNA分子方法，它可以對許多單鏈DNA進行多次測序。將標記有熒光指示劑的標記dNTPs（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）和DNA聚合酶新增到作為DNA模板的流動池中，並開始互補。單分子測序儀可以糾正測序過程中的錯誤。洗滌步驟用於去除過量的核苷酸。剩餘的核苷酸被捕獲並分析。
這指的是一整類測序方法。通常用於查詢已知DNA序列中的微小變化，它對單鹼基錯配敏感。在其中，將SBH晶片上的短核苷酸序列插入到所需DNA序列的溶液中。然後，探針（或具有特定序列的單個DNA片段）繫結找到的序列，並用於找到整個序列。這種方法的問題是，必須找到最少的探針數量才能測序最多的DNA。這項技術最早於1988年提出，並於1991年用於重建一個100個鹼基對的DNA序列。大體上分為兩個步驟，第一步是將DNA與微陣列雜交，第二步是將它們結合起來並從一組k-mer中透過演算法重建它們。
這種方法一次可以測序大約100個鹼基對，但其解析度還需要改進。MALDI和ESI是最常用的電離方法，其競爭優勢在於它可以在幾個小時內完成，而不是像其他方法那樣需要幾天。質譜測序的優勢在於可以識別移碼突變和雜合突變。與其他方法（如Sanger測序）不同，可以確定長度相同但DNA組成不同的DNA片段。可以對這些DNA測序片段進行MALDI-TOF MS，並且可以非常準確地確定鹼基。
這種方法使用電子顯微鏡掃描DNA表面，並獲得被研究片段的奈米級解析度。這隻需要極少量的DNA，大約幾納克。使用這種方法，可以分析不同型別的DNA片段，例如超螺旋、線性或鬆弛DNA。它的一個優勢是不需要使用染色劑或放射性試劑，因此對被測序的片段造成的損傷較小。它還提供了3D影像而不是2D影像。
這種方法由GNN總裁J. Craig Venter於1996年創立，它依賴於從基因組中分離出隨機的DNA片段，然後進行多次分離以獲得冗餘複製。然後，透過它們重疊的區域將增加的DNA片段組裝起來，形成一個連續的轉錄本，通常使用計算機完成。最後，定製引物描述了這些轉錄本之間的間隙，從而給出測序的基因組。這種方法可以實現更快的測序，例如用於查詢天花的基因組。全基因組鳥槍法測序分幾個步驟進行。首先，將DNA再次分離成隨機片段，然後克隆到合適的載體中。首先分離DNA，然後透過攪拌機、窄口注射器或超聲處理將其剪下成幾個片段，通常每個片段大約2,000個鹼基對。然後將這種DNA載入到凝膠中，並與已載入的標記DNA進行比較。然後回收指定DNA並連線到克隆載體中，從而擴增所需的DNA序列。然後將序列兩側的引物退火併透過測序儀進行分析。然後，所有序列（通常為500個鹼基對）透過複雜的計算機演算法進行比較，並找到最大的可能的連續片段，然後將整個基因組拼湊起來。這種方法最普遍的批評是它不夠準確，然而，在2000年，Celera成功地測序了果蠅的基因組。
這種型別的測序被用於人類基因組計劃。它比鳥槍法慢得多，但它是一種更可靠的測序方法。它從首先建立人類基因組圖譜開始，然後再進行測序。將人類染色體剪下成片段，然後在實際測序開始之前先確定這些片段的順序。首先，將基因組剪下成150kb長的片段。然後，將這些150kb片段插入BAC中，BAC是一種人工細菌染色體。這些片段構成BAC文庫，就像一個真正的圖書館一樣。因此，每個BAC片段就像一本書，可以從圖書館中選擇。下一步是對片段進行指紋識別，方法是用酶將BAC片段剪下成更小的片段。找到重疊部分中的共同序列將能夠確定BAC在每條染色體上的位置。這使得研究人員能夠確定它們沿著染色體的片段順序。下一步是將BAC分解成更小的片段，大約1.5kb長，然後插入人工DNA中。這種DNA被稱為M13，這些片段構成M13文庫，就像BAC文庫一樣。然後對M13文庫進行測序，並將所有片段組合起來以找到順序。這通常由計算機完成，因為測序非常複雜。與鳥槍法測序相比，BAC測序需要更長的時間，並且對於更大的基因組更有用。
這種方法用於檢查DNA樣本中是否存在特定的DNA。它使用瓊脂糖凝膠電泳以及將分離的DNA轉移到濾膜上進行探針雜交的方法。首先，限制性內切酶將DNA剪下成小片段，然後將這些片段在瓊脂糖凝膠上進行電泳。接下來，可以將DNA分解成合適的小片段，然後在鹼性溶液中變性。接下來，將一張硝酸纖維素膜放在凝膠上，施加均勻的壓力。然後將其置於高溫烘箱中或暴露在紫外線照射下，以利用DNA與膜之間的共價交聯。在此之後，將標記的雜交探針放入膜中，然後洗掉，並在X射線膠片上透過放射自顯影找到圖案。P-32 ATP是允許放射自顯影的探針。
DNA測序的另一種方法是**染料終止子測序法**。這種方法可以在一個反應中完成，這非常有利。使用這種方法，四種雙脫氧核苷酸鏈終止子中的每一種都用不同的熒光染料標記，這些染料在不同的波長下發出熒光。然後可以使用帶控制序列分析儀的計算機完成測序。這種方法的一個問題是，電子DNA序列追蹤色譜圖中可能存在峰高和峰形不一致的情況。然而，解決這個問題的方法是使用新的DNA聚合酶和染料，這些酶和染料可以限制變異性和染料斑點。這種測序方法非常常用，尤其是在它比其他方法更快且成本更低的情況下。
Sanger雙脫氧方法用於測序DNA。這個過程快速簡單，涉及使用DNA聚合酶合成一個互補序列，該序列包含在四個脫氧核糖核苷酸鹼基上的熒光標籤。然後透過電泳或色譜法分離包含熒光鹼基的DNA鏈片段，然後將其送入檢測器。測序基因組DNA的另一種方法是鳥槍法。
艾德曼降解法用於測定蛋白質的序列。苯異硫氰酸酯與N端氨基酸中的氨基反應，然後酸化將其移除。高效液相色譜法（HPLC）用於鑑定氨基酸。對每個後續蛋白質重複該過程。
DNA測序中蛋白質陣列的順序組裝和重組是必要的，因為它是協調執行DNA複製的起始、延伸和終止過程的關鍵。該過程的生理意義表明，與複製叉的組裝和監測相關的蛋白質缺陷會導致基因組不穩定，這可能進一步導致癌變。它也可能導致一系列被稱為“染色體不穩定綜合徵”的疾病。
真核細胞中DNA複製的一個關鍵特徵是它具有高度適應性或可塑性。這種可塑性和適應能力體現在叉速率和複製起點選擇過程相互調節，以及當叉子停滯時非活性複製起點被啟用。在複製過程中，DNA解旋酶完成複製，DNA聚合酶延伸DNA鏈。
DNA複製過程中的錯誤或缺陷通常會導致有害影響，例如基因組不穩定。這種型別的錯誤會導致突變和疾病，例如癌症，其表現為異常組織生長，並且還可能導致被稱為“染色體不穩定綜合徵”的一組疾病。
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