結構生物化學/DNA重組技術/DNA合成
DNA可以透過自動化固相技術合成，就像合成多肽一樣。將單體連線到不溶性柱上，然後按照感興趣的序列順序新增活化的單體，形成寡核苷酸。活化的單體是脫氧核苷3'-磷醯胺。活化意味著反應性基團，第五碳 (5') 上的羥基被DMT（二甲氧基三苯甲基）取代。它使脫氧核苷3'-磷醯胺分子遠離5'上任何進一步的反應。因此，它被稱為保護基團。3'-磷醯基團被β-氰乙基 (βCE) 基團保護。由於它是連線到不溶性載體的3'-磷醯基團，因此鏈是在3'到5'*方向上合成的。寡核苷酸的合成包括三個基本步驟。
- 3' 到 5'，意味著 5'羥基對進入單體的 3'-磷醯胺進行親核攻擊。這與天然DNA和RNA的正常5'到3'合成不同，在天然DNA和RNA中，3'羥基攻擊5'三磷酸的最內側磷原子。
第一步：該程式從脫氧核苷3'-磷醯胺（已經添加了DMT來保護5'，並且添加了βCE來保護3'-磷醯基）與正在生長的鏈反應，透過偶聯形成磷酸三酯基團開始。這種偶聯反應是由要新增的核苷的5'碳上的親核羥基基團攻擊現有鏈上的親電磷原子驅動的，-NR2（通常是二異丙胺，一種相對穩定的仲胺）作為離去基團。該反應在無水環境中進行，以防止水水解3'-磷醯胺，導致反應意外逆轉。並防止水與進入單體的3'-磷醯胺發生反應。一旦水攻擊了3'-磷醯胺，它就不再能夠接受正在生長的鏈的5'OH的親核攻擊。
第二步：使用碘，I2，將磷酸三酯基團氧化為磷酸三酯基團。
第三步：透過新增二氯乙酸（DCA，CHCl2COOH）去除活化單體5'側的DMT基團，而其餘分子保持不變。
寡核苷酸現在透過一個單體單元延長，並準備與另一個進入的活化單體反應。當合成所需的長度的寡核苷酸時，可以透過新增氨 (NH3) 來去除所有保護基團，並將產物從不溶性載體上移除。因為沒有合成是完美的，並非所有生長的寡核苷酸每次都會與新增的單體反應。一些寡核苷酸將比其他寡核苷酸短，因為一些核苷酸丟失了。因此，這被認為是雜質，因為它們沒有我們想要的精確序列攜帶精確的基因。最終產品是那些最長的。可以透過凝膠電泳分離新合成的寡核苷酸的混合物，以獲得最初感興趣的所需產物。
完成所有合成步驟後，將產物混合物置於濃縮氫氧化銨，NH4OH中，在室溫下放置一小時。接下來，將含有氫氧化銨的混合物置於冰浴中，然後轉移到帶有螺帽的瓶中。為了去除雜環鹼保護基團，將瓶中的溶液在55 oC下加熱過夜。第二天，將溶液在冰浴中冷卻，並蒸發至乾燥。
可以使用四種方法來分析合成的DNA。
1. 高壓（效能）液相色譜（HPLC）。
高效液相色譜是一種用於識別或分離化合物的技術。它包括兩種基本形式，反相和離子交換。HPLC的分離和分析基於固定相（色譜填料）和流動相（需要識別或分離的化合物）在色譜柱中的保留時間。
離子交換HPLC基於固定相和流動相之間的電荷。與固定相具有相同電荷的化合物具有較短的保留時間，而與固定相具有相反電荷的化合物具有較長的保留時間。它用於長度為10至20個核苷酸的寡核苷酸。兩組離子交換HPLC用於分析DNA。一個條件是使用20mM Tris緩衝液/0.05%乙腈和1M NaCl，以1.5 mL/min的速度洗脫的dNAPac色譜柱。另一個條件是使用10mM NaOH/80mM NaBr和10mM NaOH/1.5M NaBr，以1.5mL/min的速度洗脫的Resource-Q色譜柱。
反相HPLC基於固定相和流動相之間的親和力。反相HPLC的固定相是非極性的，非極性化合物比極性化合物具有更長的保留時間。
2. 凝膠電泳
凝膠電泳是一種用於分離DNA、RNA或蛋白質分子的技術。對於寡核苷酸，使用15~20%交聯凝膠，含有7M尿素。凝膠電泳在50到60 oC下進行3~6個小時。為了觀察寡核苷酸，使用分子動力學磷光成像儀。
凝膠電泳可用於分析合成的DNA。它也用於合成DNA的純化。較長的合成DNA主要用於克隆和雜交。在寡核苷酸合成過程中形成的非全長合成DNA可能會干擾應用，因此純化很重要。凝膠電泳是一種有效分離全長產物與其他較短產物的技術。
3. MALDI-TOF分析
MALDI-TOF是一種質譜中的電離技術。它透過化合物的質量來識別化合物，例如寡核苷酸。寡核苷酸在MALDI儀器的離子室中被電離並賦予勢能。然後寡核苷酸透過將勢能轉換為動能來移動到MALDI儀器的檢測器。E=1/2mv2。由於E（能量）是給定的，v（速度）是測量的，因此可以確定核苷酸的m（質量）並將其與它應該具有的值進行比較。
4. 寡聚體的酶促降解
將產物溶解在蛇毒磷酸二酯酶、鹼性磷酸酶和緩衝溶液的混合溶液中。反應在37 oC下進行4個小時。之後，將混合物加熱以變性酶。然後用水分散混合物並離心。最後，透過HPLC分析混合物。
固相合成寡核苷酸的優點與合成多肽的優點類似。由於生長的核苷酸連線到不溶性載體上，因此所有可溶性雜質都可以被洗掉，而不會損失任何產物。
能夠合成具有精確序列的寡核苷酸具有重要的用途。合成的寡核苷酸可以用於許多DNA操作技術。
1. DNA序列
如果已知基因序列，則可以使用帶有熒游標記的合成寡核苷酸來定位非常長的DNA分子中的基因。因為我們將能夠合成一種新的寡核苷酸，它與我們要定位的基因序列互補。用作探針的標記寡核苷酸在探索新基因方面非常重要。該探針可以用作引物，透過尚未繪製的DNA聚合酶啟動鄰近DNA的複製。利用探針的熒光能力，我們能夠確定我們要定位的新基因從哪裡開始。
2. 聚合酶鏈式反應 (PCR)
聚合酶鏈式反應（PCR）是一種擴增特定DNA片段的技術。為了擴增特定的DNA序列，需要一對與目標DNA序列雜交的引物、四種脫氧核苷三磷酸和一種耐熱DNA聚合酶。用於雜交目標DNA序列的特定引物可以透過寡核苷酸合成技術製備。
3. **定點誘變**
定點誘變或寡核苷酸定向誘變可以產生具有單個氨基酸替換的突變蛋白。該技術的關鍵是製備一個與DNA互補的寡核苷酸引物，除了想要改變氨基酸的區域以外。在適當的溫度下，15個鹼基中1個鹼基的引物錯配是可以容忍的。這些特定的寡核苷酸引物可以透過寡核苷酸合成技術製備。
4. **大規模合成**
寡核苷酸的大規模合成與上述過程基本相同，只是使用了一種不同的柱子。大規模合成使用的是填充柱，而不是鬆散填充的柱。
5. **在平面玻璃表面上製備DNA微陣列**
DNA微陣列或基因晶片可以用來分析特定細胞或組織中所有基因的表達模式和水平。該技術可以透過將寡核苷酸放置在平面玻璃表面上實現。探針（寡核苷酸）在矽晶片上合成。將薄的矽橡膠毛細管放在玻璃載玻片上，併合成探針。用熒游標記的互補DNA與由寡核苷酸製成的基因晶片雜交。這種雜交的基因晶片顯示了每個基因的表達水平。
6. **Southern印跡**
Southern印跡是一種鑑定DNA分子的技術。為了鑑定具有特定序列的DNA片段，需要一個32P標記的單鏈DNA探針，即透過寡核苷酸合成製備的特定DNA分子。探針與DNA樣本的互補序列雜交。然後，可以透過放射自顯影法觀察到特定序列。