結構生物化學/DNA重組技術/電穿孔

概述

電穿孔可用於將基因插入真核細胞，如植物細胞和動物細胞，以及原核細胞，如細菌細胞。在電穿孔中，可以透過施加強電場將外源 DNA 匯入禾本科單子葉植物和雙子葉植物。

程式

以植物細胞為例。首先，植物細胞將包含細胞壁和質膜。纖維素用於消化細胞壁，創造一個具有暴露膜的植物細胞。這被稱為原生質體。其次，將外源 DNA 新增到細胞中。高電場用於產生短暫的滲透性膜，以便大分子能夠穿過膜。這是由瞬態電脈衝引起的。第三，細胞壁能夠重新生長。最後，植物細胞現在是一個具有外源 DNA 插入的可行植物細胞。

最佳化考量

當進行體外電穿孔時，必須考慮幾個因素。

• 波形 - 當電穿孔技術最初開發時，使用指數脈衝。從那時起，發現方波對細胞更有效且損傷更小。脈衝長度和幅度可以根據實驗者的需要進行修改。
• 細胞大小 - 跨膜電位由方程 ΔV(m) = fE(ext)r cosθ 描述，其中 V(m) 是跨膜電位，f 是將外部場與其對細胞的影響相關的比例常數，E(ext) 是外部施加的電場，r 是細胞半徑，θ 是場相對於細胞極的角度。這意味著細胞越小，必須施加的外部場越大才能達到相同的電穿孔效果。此外，更均勻的細胞取樣將產生更好的電穿孔結果。
• 重新封閉 - 電穿孔後的膜重新封閉是溫度依賴性的，較低的溫度與較慢的重新封閉時間相關。培養箱通常會提高結果的質量。電穿孔後等待 15 分鐘再透過移液來干擾細胞可以改善結果，因為這可以讓細胞重新封閉。使用表面活性劑泊洛沙姆 118 也可以提高重新封閉速率，以獲得更好的結果。極強的脈衝會導致不可逆的通透性。
• 金屬電極 - 對於較長的脈衝，一次性比色皿中電極釋放鋁金屬是一個問題；有時建議使用低電導率金屬。
• 脈衝介質中的金屬 - 一般來說，脈衝介質中要避免使用鈣，因為它會擾亂該離子的細胞內水平。但是，介質中的鈣或鎂通常推薦用於 DNA 轉移。

重要性

電穿孔通常用於分子生物學中將物質匯入細胞。這可以透過將分子探針載入到細胞中的物質、透過編碼 DNA 片段或透過能夠改變細胞功能的藥物來完成。在嘗試將外源基因匯入組織培養細胞時，電穿孔效率很高。例如哺乳動物細胞。該過程用於生產基因敲除小鼠。電穿孔是有益的，因為它可以用於治療腫瘤，以及細胞治療和基因治療。這被稱為轉染，它是將外源 DNA 匯入真核細胞的過程。