結構生物化學/DNA重組技術/Northern印跡
Northern印跡，也稱為RNA印跡，是用於將DNA和RNA轉移到載體上進行分類和識別的印跡技術之一。Northern印跡類似於Southern印跡，不同之處在於該技術分析的是RNA而不是DNA。首先，必須純化來自每個組織的RNA，以便可以檢查其基因表達。然後，將RNA樣品載入到瓊脂糖凝膠上。然後使凝膠經受電流，導致每個樣品中的RNA遷移到凝膠的底部。較小的RNA移動得更快，而較大的RNA移動得更慢。這種分離過程稱為電泳。然後將分離的RNA片段印跡到特殊的濾紙上，以便每個RNA分子保留其相對於所有其他分子的位置。然後將過濾器暴露於放射性探針，這些探針與印跡中互補的序列雜交。然後將過濾器放置在薄膜上進行放射自顯影，並顯影薄膜。最後，如果探針與過濾器上的RNA片段雜交，則應在放射自顯影圖上觀察到一條帶。只有在包含表達探針所代表基因的組織的柱中才能看到一條帶。
Northern印跡對於以兩種方式研究基因表達很有用。首先，印跡上條帶的位置直接衡量了RNA的大小。瞭解RNA的大小將為轉錄本的編碼能力提供估計，從而為它編碼的蛋白質的大小提供估計。其次，對來自許多不同組織的RNA樣品進行Northern印跡分析使研究人員能夠確定某個基因在哪個特定組織中表達，以及其在所有發生轉錄的細胞中的相對錶達水平。Northern印跡是研究人員確定基因表達模式的寶貴方法。例如，許多研究亨廷頓舞蹈症或乳腺癌的科學家能夠使用印跡技術確定導致這些疾病的基因的表達模式。三種印跡技術，包括Northern印跡，已被證明是科學中的重要且積極的進步。
Northern印跡 是 Southern印跡 的衍生物，它與Southern印跡一樣，利用電泳分離分析和雜交探針進行檢測。對於這兩種技術，用於檢測的雜交探針可以由DNA或RNA製成。兩種技術之間的主要區別在於Northern印跡用於透過分析RNA而不是DNA來研究基因表達。RNA有三種類型：tRNA（轉運RNA - 在多肽鏈組裝中起作用）、rRNA（核糖體RNA - 核糖體結構的一部分）和mRNA（信使RNA - DNA轉錄的產物，用於將基因翻譯成蛋白質）。正是mRNA被分離並在Northern印跡中雜交。甲醛在電泳凝膠中用作變性劑，因為Southern印跡程式中使用的氫氧化鈉處理會降解RNA。Northern印跡是由詹姆斯·阿爾溫、大衛·肯普和喬治·斯塔克在1977年在斯坦福大學開發的。
Northern印跡的步驟如下：
1) RNA分離：從細胞中提取並純化mRNA。
2) 探針生成：將mRNA載入到凝膠上進行電泳。泳道1有大小標準（已知RNA片段的混合物），泳道2有RNA。
3) 變性瓊脂糖凝膠電泳：電流透過凝膠，RNA從負電極移動。移動的距離取決於RNA片段的大小。由於基因大小不同，mRNA的大小也隨之變化。這導致凝膠上出現塗抹。標準用於量化大小。RNA可以透過首先用熒光染料染色，然後用紫外線照射來視覺化。
4) 轉移到固體載體上並固定：RNA是單鏈的，因此它可以無需任何進一步處理即可從凝膠中轉移到膜上。轉移可以透過電氣方式或透過具有高鹽溶液的毛細作用來完成。
5) 預雜交和與探針雜交：用針對所討論的RNA片段的標記探針孵育印跡。洗滌印跡以去除非特異性結合的探針[檢查拼寫] 探針，然後進行顯影步驟以視覺化結合的探針。
6) 洗滌：探針特異性地結合到目標mRNA，並且幾乎沒有非特異性結合到其他mRNA或尼龍膜本身。
7) 檢測：然後檢測雜交訊號。
8) 剝離和重新探測（可選）:
Northern印跡的這一部分是一個重要的步驟，因為需要獲得高質量的完整RNA。分離可以以多種方式進行；然而，共同屬性包括細胞裂解和膜破壞、核糖核酸酶活性的抑制、脫蛋白和完整RNA的回收。
雖然Southern印跡是以埃德溫·薩瑟恩[1]的名字命名的，但令人難以置信的是，Northern印跡是由詹姆斯·阿爾溫、大衛·肯普和喬治·斯塔克[2]開發的。“Northern印跡”這個名字僅僅是文字遊戲。Southern、Northern和Western印跡分別以其對DNA、RNA和蛋白質的分析而聞名。
Western印跡使研究人員能夠確定蛋白質的分子量，並測量不同樣品中存在的蛋白質的相對量。
程式
a) 蛋白質透過凝膠電泳分離，通常使用SDS-PAGE使所有蛋白質帶負電荷。
b) 然後將蛋白質轉移到一張特殊的印跡紙上，稱為硝酸纖維素紙，儘管可以使用其他型別的紙張或膜。蛋白質保留在它們之前在凝膠上分離的相同模式中。
c) 將印跡與通用蛋白質（例如牛奶蛋白）一起孵育，以結合硝酸纖維素上任何剩餘的粘性部位。然後將一種抗體新增到溶液中，該抗體能夠與其特異性蛋白質結合。抗體具有附著在上面的酶（例如鹼性磷酸酶或辣根過氧化物酶）或染料，目前還看不到。
d) 透過將印跡與無色底物一起孵育來顯示抗體的位點，附著在上面的酶將底物轉化為有色產物，該產物可以觀察到並拍照。
其他類似的技術，如遠端Western印跡和南方Western印跡，分別使科學家能夠檢查蛋白質-蛋白質相互作用和DNA-蛋白質相互作用。
- ↑ Berg, Jeremy M. (2007). Biochemistry (第 6 版). W. H. Freeman and Company. ISBN 0-7167-8724-5.
{{cite book}}:|edition=has extra text (help) - ↑ Alwine JC, Kemp DJ, Stark GR (1977). "透過轉移到重氮苯氧甲基紙和與DNA探針雜交來檢測瓊脂糖凝膠中特定RNA的方法". 美國國家科學院院刊. 74 (12): 5350–4. doi:10.1073/pnas.74.12.5350. PMID 414220.
{{cite journal}}: CS1 maint: multiple names: authors list (link)
3. Ambion. 應用生物系統. http://www.ambion.com/techlib/basics/northerns/index.html