結構生物化學/酶催化機制/蛋白酶/胰凝乳蛋白酶
胰凝乳蛋白酶，一種 蛋白酶，是一種透過一般酸鹼催化，但主要透過共價催化的方式裂解某些肽鍵羰基側的酶。在此機制中，親核試劑在過渡態中與底物共價結合，形成醯基酶。蛋白酶透過水解反應（加入水分子）裂解蛋白質。碳和氮之間的雙鍵加強了其鍵。胰凝乳蛋白酶具有位點特異性，只會裂解大型疏水或芳香族氨基酸（如苯丙氨酸 (Phe)、甲硫氨酸 (Met)、酪氨酸 (Tyr) 和色氨酸 (Trp)）的羧基側，除非下一個氨基酸是脯氨酸 (Pro)。胰凝乳蛋白酶優先裂解大體積疏水氨基酸的原因是形成 S1 口袋，在胰凝乳蛋白酶的情況下，該口袋由相對疏水的殘基排列，如 Ser-189、Ser-214、Trp-215、Gly-216 和 Gly-226。胰凝乳蛋白酶將反應速率催化了 109 倍。該反應分為兩個步驟：醯化階段和脫醯化階段。在第一個階段，肽鍵斷裂，並在底物和酶之間形成酯。在第二階段，這種酯被水解，酶再生。
這說明了胰凝乳蛋白酶的共價催化。第一步是醯化，形成醯基酶中間體。然後醯基酶中間體經過脫醯化反應，恢復到原始的遊離酶形式。
由於胰凝乳蛋白酶還可以催化酯和醯胺的水解，因此將對硝基苯酚乙酸酯與胰凝乳蛋白酶結合使用。與對硝基苯酚乙酸酯的反應會生成對硝基苯酚，這是一種顯色效應物，在產物中呈黃色變化。可以從顏色確定吸光度，強度可以確定產物的量。Hartley 和 Kilby 在 1954 年利用這些資訊表明，反應分兩個階段進行：爆發階段，然後進入穩態階段。因此，形成了共價結合的酶-底物中間體。
另一個確定胰凝乳蛋白酶水解機制的測試是使用有機磷酸酯，二異丙基氟磷酸酯 (DIPF) 處理蛋白酶。在這種反應中，胰凝乳蛋白酶會失去所有活性並失活。由於只有絲氨酸-195 被二異丙基氟磷酸酯修飾，因此表明絲氨酸-195 在機制中起著親核試劑的關鍵作用。它與絲氨酸-195 共價連線。胰凝乳蛋白酶的共價催化基本上經歷了醯化和脫醯化。醯化形成醯基酶中間體，脫醯化新增水，生成遊離酶。
定點誘變是另一種可以測試反應的技術，透過在酶活性位點的氨基酸序列中創造突變來進行。它透過證明透過定點誘變替換催化三聯體中的任何一個成員對反應速率都有毀滅性的影響，從而支援了下面的機制。事實上，僅僅替換三聯體中的一個成員就與替換所有三個成員具有相同的效果，這表明每個組分對有效催化至關重要。雖然酶繼續與底物結合（我們知道這一點是因為 KM 在整個替換過程中保持不變，它需要相同的底物濃度才能達到最大速率的一半），但在沒有三聯體的情況下，反應速率小几個數量級。
一級結構表明，二硫鍵對蛋白質摺疊至關重要。該蛋白質呈球狀，本身由三條多肽鏈組成。蛋白質中還有一個稱為活性位點的口袋。活性位點包括 Ser-195、His-57 和 Asp-102（催化三聯體）。Ser-195 與 His-57 形成氫鍵，而 His-57 又與 Asp-102 殘基形成氫鍵。His-57 的作用是定位絲氨酸殘基並極化羥基，使其可以被去質子化形成烷氧負離子。在底物存在的情況下，它透過充當鹼來接受質子。Asp-102 透過氫鍵和靜電相互作用定向 His-57 並穩定它。
步驟 1：當底物（多肽）結合時，待裂解肽鍵旁邊的殘基側鏈巢狀在酶上的疏水口袋中，將肽鍵定位以進行攻擊。組氨酸從絲氨酸中提取一個質子，形成烷氧負離子。這種絲氨酸離子與底物反應。
步驟 2：在胰凝乳蛋白酶中，Asp102 的羧酸鹽 R 基團與 His 57 的 R 基團形成氫鍵。當這種情況發生時，它會壓縮這種氫鍵並將電子密度轉移到 His 57 R 基團中的另一個氮原子（不參與 H 鍵），使其成為非常強的鹼。這使得 His 57 可以使 Ser195 去質子化，並將其轉化為可以攻擊底物的強親核試劑。
氧在氧陰離子孔中產生部分負電荷。
步驟 3：當底物羰基氧上的負電荷不穩定時，會導致四面體中間體坍塌，碳重新形成雙鍵，從而斷裂碳和氨基酸基團之間的肽鍵。離去基團被 His57 質子化，促進其位移。一旦氧陰離子孔穩定了負電荷，由於組氨酸的質子與氮結合，使碳的可能性降低，因此鍵斷裂。離去基團被穩定，並形成醯基酶。
步驟 4：胺組分從酶中分離（被身體代謝）並與絲氨酸結合。這完成了第一階段（酶的醯化）。第一個產物已經生成。
步驟 5：在 N 末端的位置新增一個水分子。組氨酸使水去質子化，形成羥基。這種羥基從羧基側附著到碳上，並使醯基中間體不穩定。鍵斷裂。
步驟 6：一個進入的水分子透過酸鹼催化被去質子化，產生一個強親核性的氫氧根離子。氫氧根對醯基酶的酯鍵的攻擊生成第二個四面體中間體。
步驟 7：四面體中間體坍塌，形成第二個產物，羧酸根陰離子，並取代 Ser195。組氨酸的質子返回到絲氨酸。
步驟 8：羧酸被釋放，酶恢復到其原始活性位點，以催化下一個反應。
