結構生物化學/膜蛋白/膜蛋白研究方法

研究膜蛋白非常困難。提取、純化、均質化或從膜中去除它們可能意味著嚴重的資訊丟失以及蛋白質解旋和展開。研究蛋白質膜的最佳方法是在細胞中模擬它們的天然環境，嵌入或附著在細胞膜上。

X射線晶體學

膜蛋白被證明透過X射線晶體學非常難以結晶，這主要歸因於主要結構中存在的大量非極性氨基酸。傳統上，在結晶膜蛋白樣品時，科學家試圖在樣品製備過程中去除圍繞膜蛋白的大量脂質。然而，現在科學家開始認識到脂質在結晶過程中是重要的新增劑。脂質新增或脂質立方相的使用導致越來越多的已解決膜蛋白。隨著脂質的附著，科學家能夠對蛋白質和脂質之間的不同相互作用進行分類和弄清楚。

脂肽類去垢劑

傳統上，去垢劑已被用於提取用於研究的蛋白質-去垢劑複合物（PDC）的膜蛋白，例如X射線晶體學或核磁共振。所用特定去垢劑的有效性基於所需的蛋白質。各種去垢劑形成球形或橢球形膠束，這些膠束不能很好地模仿細胞膜以與蛋白質形成複合物。處於這種去垢劑溶解狀態的膜蛋白容易出現不可逆聚集或其天然結構丟失等問題。在去垢劑中溶解也會導致結合的去垢劑分子與溶液中游離的分子不斷快速交換。這使得核磁共振譜學非常困難，因為它通常需要在較長時間內保持高溫。核磁共振一直侷限於特別耐用的蛋白質。此外，由於與蛋白質結合的去垢劑分子數量，結構看起來是無序的，並且在電子密度圖中不可見。

去垢劑的這個問題導致科學家認為膜蛋白相對於其他蛋白質來說很脆弱。然而，當在細胞膜中時，整合蛋白被多種因素穩定，包括蛋白質疏水部分的遮蔽以及脂質雙層施加的側向壓力。這些因素在去垢劑溶解狀態下不存在。此外，可能出現來自去垢劑的偽影。這會導致膜蛋白更容易失去其天然結構，這也導致蛋白質失活。所用去垢劑的有效性基於所用特定蛋白質和去垢劑。較差的去垢劑將無法很好地替代脂質雙層，導致蛋白質降解。所有這些都會干擾蛋白質的研究。目前，十二烷基-β-D-麥芽吡喃糖苷（DDM）是目前最有效的去垢劑，用於維持蛋白質穩定性。這是由於去垢劑形成的大膠束更能模仿脂質雙層。

PDC是溶解的膜蛋白，與去垢劑形成複合物。該顆粒存在於溶液中，與遊離的去垢劑單體和去垢劑膠束一起存在。結合的去垢劑分子與溶液中游離的分子之間存在持續交換。與目標蛋白結合的去垢劑數量可能佔PDC質量的30-70%，相當於數百個結合到蛋白質上的去垢劑分子。這些分子也沒有沿著蛋白質的疏水部分排列它們的疏水鏈。相反，它們以垂直於蛋白質的方式排列，並且在X射線晶體結構和電子密度圖中看起來是無序的。

另一種去垢劑已被開發出來，能夠更有效地複製膜雙層，以穩定膜蛋白，使其能夠更有效地研究，同時還能正常發揮作用。脂肽類去垢劑是兩親性分子，具有 25 個殘基的肽，形成一個兩親性 α-螺旋，在 2 和 24 位具有 12 到 20 個碳的兩個脂肪酸基團。這些鏈沿著疏水錶面排列，形成一個楔形振動。它們能夠形成小的圓柱形膠束，其內部更類似於脂質雙層。這使膜蛋白能夠更長時間地抵抗聚集和變性。此外，與傳統去垢劑相比，脂肽類去垢劑相對較小，並保持剛性的外部表面。複合物的剛性有利於結晶和核磁共振。例如，X射線晶體學使用傳統去垢劑提供了 10Å 的解析度，而脂肽類去垢劑由於脂肽類去垢劑的高度有序性，能夠提供 1.20Å 的解析度。

然而，脂肽類去垢劑無法替代 PDC，因為它們成本更高。目前，膜蛋白的純化仍使用 PDC 來提取蛋白質並使其溶解。一旦提取蛋白質，將脂肽類去垢劑新增到溶液中，並將混合物透過超濾濃縮器進行離心濃縮，使較小的脂肽類去垢劑能夠透過，同時過濾掉較大的 PDC 複合物。向溶液中新增更多緩衝液並重復過濾過程數次，結果是去除 PDC 並將穩定的蛋白質溶解在脂肽類去垢劑中。這種方法需要最少使用脂肽類去垢劑，這降低了膜蛋白研究的成本。

雖然脂肽類去垢劑是研究蛋白質結構的相對較新且有效的工具，但它只是研究蛋白質的另一種方法。它不是蛋白質研究中各種問題的唯一解決方案。然而，它確實提供了一條新的途徑來研究對早期方法構成挑戰的更多整合蛋白。脂肽類去垢劑。

溶解環境對膜蛋白的重要性

細胞膜構成一系列不同的成分。異質環境影響膜蛋白的結構，因此影響其功能。這種異質環境使目前的方法難以確定膜蛋白的結構，因為膜環境的改變會導致結構發生改變。儘管膜蛋白因其在生物學中的作用而非常重要，但只有很少一部分的結構得到了確定。

對於較小的蛋白質和沒有輔基的蛋白質，蛋白質-膜相互作用大於蛋白質內相互作用。輔基透過穩定蛋白質跨膜結構域來幫助克服蛋白質-膜相互作用。對於較大的蛋白質，蛋白質內相互作用足以克服這些相互作用。因此，在破譯較小蛋白質的結構時，必須特別注意其環境。由於膜蛋白具有顯著的構象靈活性，這對於其在天然條件下的功能可能是必要的。這方面的例子是離子通道在開啟或關閉時發生的結構變化。這兩種結構都有助於蛋白質的功能，並且需要膜透過克服蛋白質-膜相互作用來允許這種變化發生。也可能存在不影響蛋白質功能的構象變化，甚至可能抑制蛋白質的功能。這些變化可能是由相同的蛋白質-膜相互作用引起的。這在解開新蛋白質的結構時引起了特別的關注。

膜蛋白

這種關注是所分析的結構是否實際上是蛋白質的功能結構之一。在流感 A 病毒 M2 蛋白中可以看到這種情況。該蛋白質的結構已從液態液晶脂質雙層樣品、從去垢劑中結晶的樣品以及去垢劑膠束中的樣品中確定。每個樣品代表不同的蛋白質結構，目前尚不清楚哪一種結構有助於蛋白質的功能。瞭解哪些結構與功能相關將有助於開發能夠有效破壞病毒複製並防止流感大流行的藥物，這些病毒會發生變異，不再對之前的藥物治療敏感。

在使用去垢劑溶解蛋白質時，務必注意脂類和去垢劑之間的差異會影響蛋白質結構。一個區別是單體脂類濃度比單體去垢劑的毫摩爾濃度低幾個數量級。在一些蛋白質晶體結構中，這些單體去垢劑被觀察到滲透到蛋白質結構域的水性孔中，這會損害其功能。其次，去垢劑膠束在其疏水部分是可以擴充套件的。這會導致設計為具有疏水失配的螺旋誘導螺旋傾斜，並導致它們緊密堆積。這也會影響蛋白質功能。最後，與膜表面相比，膠束表面的曲率更大。這種曲率的變化也會干擾兩親螺旋的表面結合。所有這些變化都涉及膜蛋白的環境。這些相互作用會對蛋白質結構產生重大影響，需要進一步研究才能揭示兩者之間所有關係。