結構生物化學/核酸/DNA/基因敲除小鼠

一般資訊

基因敲除小鼠是研究人員用於實驗室實驗的小鼠，旨在瞭解特定基因失活或“敲除”的後果。一般來說，在生物體中為了實驗目的進行基因過表達或表達不足被稱為轉基因技術 。此過程透過破壞或用人工 DNA 片段（目標基因的突變版本）替換現有基因來完成 。由於破壞，基因活性會喪失，從而導致小鼠表型的變化。當小鼠表型受到影響時，外觀、行為和其他身體特徵的變化應該在後代中顯而易見。

目的和應用

由於小鼠和人類的許多基因相似，從小鼠中提取或“敲除”特定基因可以提供證據，以進一步瞭解基因在人類中的功能程度 。這通常表現為動物的物理特徵、行為特徵或調節小鼠功能的生化途徑的變化 。這種實驗室技術已應用於各種型別的研究

• 癌症研究
• 囊性纖維化
• 肺、心臟、血液和帕金森病
• 衰老
• 焦慮
• 關節炎
• 糖尿病
• 肥胖
• 神經通路功能
• 藥物濫用

從基因敲除小鼠中研究的特定基因也可用於研究不同的娛樂性藥物如何影響動物，這可用於測試針對人類藥物濫用的療法 。例如，p53 基因敲除小鼠側重於一種機制 - p53 - 它編碼抑制腫瘤生長並阻止細胞分裂的蛋白質。透過去除該基因，小鼠有患各種型別癌症（血液、肺、腦、骨骼等）的風險。這很有用，因為人類的這種基因異常會導致 **李-弗勞梅尼綜合徵**，這是一種罕見的常染色體顯性遺傳疾病，會導致人們患癌風險大大增加。

侷限性和弱點

雖然基因敲除小鼠技術是一種極好的研究工具，但在敲除特定基因時，經常會出現併發症。例如，小鼠可能依賴於感興趣的基因來執行其他重要的身體功能；如果該基因被破壞，小鼠可能會死亡或以意想不到的方式停止正常運作。此外，在小鼠中被敲除的基因甚至可能不會在小鼠的任何特徵中產生可觀察到的變化。這使得很難將研究與人類研究聯絡起來。小鼠胚胎中的基因敲除有時會抑制小鼠長成成年小鼠。這使得研究侷限於小鼠的產前階段，進一步擴大了小鼠中的基因敲除與人類之間的聯絡。

製備基因敲除小鼠的方法

基因敲除小鼠繁育方案

基因敲除小鼠是由胚胎幹細胞（ES 細胞）產生的，這些細胞是在受精後大約 4 天收穫的。使用 ES 細胞的原因是因為在如此早的階段，基因序列的交換可以在細胞分裂期間正確地傳遞給其餘細胞，並隨著所有其他成體細胞一起發育。此過程透過以下兩種方法之一完成

基因靶向

在基因靶向中，透過同源重組 在小鼠 ES 細胞的細胞核內操縱特定基因。要開始同源重組，需要知道需要替換的基因的 DNA 序列。下一步是製作一個需要插入染色體的新的 DNA 序列。該染色體將取代野生型等位基因。人工非活性 DNA 序列被引入（這部分序列與被敲除的基因幾乎完全相同）。此人工序列在染色體上以兩個方向包圍 DNA 序列。細胞識別相同的 DNA 片段，並將現有基因與人工 DNA 進行“交換”。由於人工 DNA 是非活性的，因此現有基因的功能現在已被基因靶向“敲除”。新細胞將繼續生長和分裂，其中包含新的基因。

**示例：**分離來自灰毛物種的囊胚階段小鼠的胚胎。然後，從囊胚中取出胚胎幹細胞，並在組織培養中進行培養。轉移同源重組基因，並在甘昔洛韋和新黴素中培養。然後將具有新的白色毛髮基因的細胞轉移回囊胚。許多轉化的囊胚將被植入具有白色毛髮的假孕小鼠中。小鼠將產下一部分白色小鼠，一部分帶有灰色斑點的小鼠，表明舊基因的活性。帶有斑點的小鼠 - 意味著它們既有灰色毛髮基因，也有白色毛髮基因 - 將與白色小鼠交配。如果灰色白色小鼠的配子來自重組幹細胞，那麼它將產下全部灰色小鼠。小鼠體內的所有細胞都對毛髮基因雜合。然後，灰色小鼠將與雜合小鼠一起交配。確定哪隻小鼠具有純合重組基因，並交配它們，直到兩個等位基因都被敲除。最終結果是基因敲除小鼠，此時兩個等位基因都被敲除。

基因陷俘

基因陷俘是透過使用人工 DNA 序列來完成的，該序列包含一個“報告基因”，該基因被設計成隨機插入任何基因中。人工 DNA 阻止細胞中的 RNA 剪接，從而阻止現有基因合成其指定蛋白，並消除其功能。現在可以觀察和研究人工“報告基因”的活性，以確定現有基因在小鼠中的正常功能。

哪種方法更好？

這兩種方法都使用 DNA 載體將人工 DNA 匯入小鼠胚胎幹細胞。 DNA 注入後，細胞在體外培養，然後注入小鼠胚胎。 這些胚胎被植入雌性小鼠體內，雌性小鼠隨後產下基因敲除的小鼠。

兩種方法都有各自的優勢。 例如，在基因靶向中，靶基因在 DNA 序列中是已知的。 這種方法允許研究人員敲除他們發現有趣的序列。 另一方面，雖然基因捕獲中敲除的特定基因未知，但它會創造不同型別的小鼠，因為“報告基因”的結合沒有效率或精度； 由於隨機性，找到特定基因的功能可能變得很麻煩。 研究人員需要花費大量時間測試 ES 細胞以確定哪個基因已被敲除。 此外，可能以隨機方式敲除一個不容易選擇的特定基因。

資源

1. 維基百科：基因敲除小鼠 [1]
2. 國家人類基因組研究所：基因敲除小鼠 [2]