結構生物化學/核酸/DNA
什麼是 DNA？ DNA 是一種長鏈線性聚合物，包含脫氧核糖和共價鍵合的鹼基，被稱為核酸。DNA 的主要功能之一是儲存遺傳資訊。在 DNA 中，三個鹼基的序列被稱為密碼子，負責編碼單個氨基酸。氨基酸在翻譯過程中被新增到正在生長的蛋白質中。這些核酸聚合物以基因的形式編碼生物體生存所需的所有物質。基因是 DNA 的小片段，它告訴細胞應該建立哪些蛋白質。給定細胞接收的基因型別完全取決於親代細胞。基因在代代相傳，以確保生物體在遺傳上的生存。
DNA 代表脫氧核糖核酸。字首“脫氧”將 DNA 與其近親 RNA（核糖核酸）區分開來。該字首表明，與核糖不同，脫氧核糖在 2' 碳處不含羥基，而是用單個氫原子替換了它。這種羥基的缺失對於確定 DNA 能夠在細胞核中自我濃縮的方式至關重要。
DNA 是一種核酸，能夠透過稱為 DNA 聚合酶的酶自我複製。DNA 上的四個鹼基，腺嘌呤 (A)、胞嘧啶 (C)、鳥嘌呤 (G) 和胸腺嘧啶 (T) 中的每一個都共價鍵合到脫氧核糖上。DNA 中的四個核苷酸單元稱為脫氧腺苷酸、脫氧鳥苷酸、脫氧胞苷酸和胸苷酸。核苷酸包括核苷，即與脫氧核糖或核糖基團鍵合的含氮鹼基。DNA 中的四個核苷是脫氧腺苷、脫氧鳥苷、脫氧胞苷和胸腺嘧啶。透過將一個或多個磷酸基團透過酯鍵連線到核苷，形成核苷酸。
脫氧核糖透過一個 磷酸二酯鍵 形成 DNA 的結構主鏈，該鍵位於一個核苷酸的 3' 碳和下一個核苷酸的 5' 碳之間。當 DNA 不自我複製時，它以雙鏈螺旋分子的形式存在於細胞中，鏈彼此反平行排列。也就是說，如果一條鏈的方向是 3' 到 5'，則另一條鏈的方向將是 5' 到 3'。每條鏈的鹼基非常特異性地結合在一起，A 與 T 結合，C 與 G 結合，至少在 DNA 中不存在其他組合。鹼基透過氫鍵相互內部結合，磷酸二酯鍵 主鏈朝外。正是這裡，缺少的 2' 羥基在 DNA 中起著重要作用。正是由於該基團的缺失，DNA 才能形成其傳統的雙螺旋結構。RNA 在 2' 碳處確實具有一個羥基，無法獲得相同的螺旋結構。沃森和克里克首次提出了現代的雙螺旋 DNA 結構，並且 DNA 的功能在一系列實驗中得到證實，這些實驗將在接下來的幾節中討論。
為什麼是 DNA？ 值得注意的是，DNA 是所有細胞傳遞遺傳資訊的主要方法的原因。也就是說，為什麼進化偏愛 DNA 世界而不是 RNA 世界，因為這兩種分子在結構上如此相似？這些原因包括化學穩定性、形成和斷裂化學鍵所需的能量以及執行此任務的酶的可用性。主要原因涉及兩種分子的相對穩定性。DNA 比 RNA 更具化學穩定性，因為它在 2' 碳上缺少羥基。在 RNA 中，分子可以形成 磷酸二酯鍵 的兩個可能的 OH 基團，這意味著 RNA 不像其脫氧對應物那樣被強制進入相同的剛性結構。此外，DNA 中的 脫氧核糖 比 核糖 在 RNA 中的反應性要低得多。簡而言之，C-H 基團比 C-OH（羥基）基團的反應性要低得多。這種差異也解釋了為什麼 RNA 在鹼性條件下不穩定，而 DNA 則穩定。鹼性條件下的鹼基與 C2 位置的 -OH 基團的作用相同。此外，雙鏈 DNA 具有相對較小的溝槽，破壞性酶無法附著，使其更難“攻擊” DNA。另一方面，雙鏈 RNA 具有更大的溝槽，因此更容易被酶分解。雙鏈 DNA 之間的連線比雙鏈 RNA 之間的連線更緊密。換句話說，解開雙鏈 RNA 比解開雙鏈 DNA 要容易得多。總的來說，RNA 的分解和重組比 DNA 的分解和重組速度更快，所需的能量更少。對於生物體的生存和健康而言，將遺傳物質編碼成更穩定、更抗變化的東西至關重要。此外，DNA 的序列及其物理構象似乎在 DNA 的選擇中也起著作用。另一個有助於闡明 DNA 作為遺傳資訊主要儲存方式的普遍性的觀點是分解 DNA 的酶的可用性。人體主動破壞外源核酸酶，核酸酶是切割 DNA 的酶。這只是 DNA 免受損傷的眾多方式之一。人體實際上可以識別外源 DNA 並將其破壞，同時保持自身 DNA 完整無損。
高色效應 DNA 另一個獨特的特徵是其雙鏈形式的 高色效應，它描述了與分子非螺旋構象相比，雙螺旋鏈對紫外電磁輻射的吸收降低。由於螺旋構象中糖堆積，互補 DNA 鏈之間的氫鍵導致芳香環變得更加穩定，因此吸收的紫外輻射更少。這最終使紫外吸收量降低了 40%。隨著溫度的升高，這些氫鍵溶解，螺旋結構開始解開。在這種解開的形式中，芳香環可以自由地吸收更多的紫外輻射。
1. 由 2 條鏈組成（反平行且互補）：DNA 具有兩條多核苷酸鏈，它們以相反的方向圍繞螺旋軸扭曲。
2. 它由脫氧核糖、外部的磷酸骨架和內部的核酸鹼基組成。
3. 鹼基垂直於螺旋軸，相隔 3.4 埃。
4. 鏈透過氫鍵和其他各種分子間力結合在一起，形成雙螺旋。鹼基配對涉及 A - T 的 2 個氫鍵和 C - G 的 3 個氫鍵 - 請參見右側的影像
5. 骨架由交替的糖和磷酸鹽組成，其中磷酸二酯鍵構成 DNA 的共價骨架。DNA 的方向是從 5' 磷酸基團到 3' 羥基。
6. 每 10 個鹼基重複一次
7. 由於疏水效應和範德華力，弱力穩定 DNA。
8. DNA 鏈寬 20 埃（2 奈米）
9. 一個核苷酸單元長 3.3 埃（0.33 奈米）
DNA 由兩條多核苷酸鏈（鏈）組成，它們圍繞公共軸以相反的方向執行。因此，DNA 具有雙螺旋結構。DNA 的每條多核苷酸鏈都由單體單元組成。一個單體單元由三個主要成分組成，即糖、磷酸鹽和含氮鹼基。DNA 單體單元中使用的糖是脫氧核糖（它在呋喃糖環的第二個碳上缺少一個氧原子）。DNA 單體單元中還可以使用四種可能的含氮鹼基。這些鹼基是腺嘌呤 (A)、鳥嘌呤 (G)、胞嘧啶 (C) 和胸腺嘧啶 (T)。腺嘌呤 和鳥嘌呤 是嘌呤 衍生物，而胞嘧啶 和胸腺嘧啶 是嘧啶 衍生物。聚合物鏈是透過磷酸二酯鍵連線核苷（與含氮鹼基共價連線的糖）而形成的。聚合物鏈是 DNA 分子的單鏈。兩條鏈以相反的方向執行以形成雙螺旋。使這些鏈保持在一起的力是氫鍵、疏水相互作用、範德華力和電荷-電荷相互作用。氫鍵在反平行鏈的鹼基對之間形成。第一條鏈中的鹼基僅與第二條鏈中的特定鹼基形成氫鍵。這兩個鹼基形成一個鹼基對（使鏈保持在一起並形成雙螺旋結構的氫鍵相互作用）。鹼基對是：腺嘌呤-胸腺嘧啶 (A-T)、胞嘧啶-鳥嘌呤 (C-G)。這種相互作用給了我們提示，含氮鹼基位於 DNA 雙螺旋結構的內部，而糖和磷酸鹽位於雙螺旋結構的外部。疏水鹼基位於 DNA 的雙螺旋內部。位於雙螺旋內部的鹼基一個疊一個地堆積起來。堆積的鹼基透過範德華力相互作用。即使範德華力很弱，這些力的總和也可能是相當大的。兩個相鄰鹼基之間的距離（垂直於主軸）為 3.4 A˚。DNA 結構 是重複的。每圈有十個鹼基，因此每個鹼基的旋轉角度為 36°。雙螺旋的直徑約為 20 A˚。疏水效應使雙螺旋穩定。DNA 的結構變化是由於不同的脫氧核糖構象、磷酸脫氧核糖骨架中連續鍵的旋轉以及圍繞 C-1'- N（糖苷鍵）的自由旋轉造成的。
Southern 印跡技術通常用於發現樣品的 DNA 序列。該技術以埃德溫·薩瑟恩命名。
在探索基因和基因組時，這取決於所使用的技術工具。五種重要的 DNA 操作技術是
1. 限制性核酸內切酶 - 也稱為限制性酶
限制性酶將 DNA 分裂成特定的片段。透過將 DNA 分裂成不同的片段，可以操縱 DNA 片段。
2. 印跡技術
為了分離和表徵 DNA，使用 Southern 印跡技術。該技術類似於 Western 印跡，不同的是 Southern 印跡用於 DNA 而不是 RNA。該技術透過瓊脂糖凝膠電泳鑑定特定的 DNA 序列。將大片段放在頂部，小片段放在底部，分離 DNA。接下來，將 DNA 轉移到硝酸纖維素膜上。然後，新增與該序列互補的 32-p 標記的 DNA 探針以雜交片段。最後，使用放射自顯影膜來檢視包含該序列的片段。
3. DNA 測序
透過使用 DNA 測序技術，可以確定 DNA 分子的精確核苷酸序列。DNA 測序的關鍵是生成長度取決於序列最後一個鹼基的 DNA 片段。儘管存在不同的替代方法，但它們都在四個反應混合物上執行相同的程式。
A. 鏈終止 DNA 測序
總是需要引物。為了產生片段，在四種混合物中的每一種中都添加了 dNTP 的 2', 3'- 二脫氧類似物。它將停止該 N- 二脫氧的序列。可以使用 dNTP 的型別是 dATP、TTP、dCTP、dGTP。最後，新的 DNA 鏈被分離以進行電泳。
B. 鹼基的熒光檢測
在四種鏈終止二脫氧核苷酸的每一種中，以不同的波長使用熒游標記。它是一種有效的方法，因為它不使用放射性試劑，並且可以確定大量鹼基序列。透過使混合物透過高壓分離片段。然後，透過其熒光檢測片段，鹼基序列基於顏色序列。
C. 自上而下（鳥槍法）基因組測序方法
自上而下方法和鳥槍法類似，主要區別在於自上而下方法需要詳細的克隆圖。鳥槍法隨機對大型克隆進行測序，以便在計算上進行匹配。
D. 微陣列（綠色晶片）)
在研究大量基因的表達時，使用微陣列很有用。微陣列是透過使用寡核苷酸或 cDNA 建立的。根據熒光強度，將出現紅色或綠色標記。如果為紅色，則表示沒有熒光，稱為基因誘導。如果為綠色，則表示熒光表達，稱為基因抑制。
4. DNA 合成
為了合成 DNA，使用固相方法。固相合成是透過亞磷酸三酯法進行的。在這個過程中，每一組只新增一個核苷酸。第一步是結合第一個核苷酸。新增另一個核苷酸並被啟用並與包含 DMT 的 3' - 磷醯胺酯反應。連線具有 DMT 和 βCE 的脫氧核苷 3' - 磷醯胺酯，因為它具有合成任何 DNA 的能力。它也是一種經過修飾和保護的鹼基核苷酸。然後，該分子被氧化以氧化磷酸基團。最後，透過新增二氯乙酸去除 DMT。總的來說，所需產物仍然不溶，並在最後釋放。
5. 聚合酶鏈式反應 (PCR)
PCR 是一種用於擴增兩個核苷酸之間 DNA 序列的技術。如果已知 DNA 序列，則可以使用該技術獲得該序列的數百萬個複製。為了進行 PCR，需要 DNA 模板、前體和兩個互補引物。使 PCR 獨特的是，溫度在三個不同階段不斷變化，並且這些階段重複 25 次。三個階段是
1. 變性 - 透過將溶液在 94°C 下加熱，DNA 從雙鏈（親本 DNA 分子）變性為兩條單鏈。
2. 退火 - 讓溶液冷卻後，在靶鏈的 3' 端和互補鏈的 3' 端新增兩個合成寡核苷酸引物。當溫度在 50°C - 60°C 之間時，完成此過程。
3. 聚合 - 在 72°C 下新增耐熱 DNA 聚合酶以催化 5' 到 3' DNA 合成。
結構變異是由於不同的脫氧核糖構象、圍繞 C-1 的自由旋轉以及磷酸脫氧核糖骨架中最近鍵的旋轉造成的。
DNA 有 A、B 和 Z 三種形式的二級結構。A 形：1. 右手螺旋 2. 糖苷鍵構象為反式 3. 每螺旋圈需要 11 個鹼基對 4. 直徑大小約為 26 埃 5. 糖皺褶構象位於 C-3' 內側。
B 形：1. 與 A 形類似，B 形為右手螺旋。2. 糖苷鍵形成是反式 3. 每螺旋圈需要 10.5 個鹼基對 4. 直徑大小約為 20 埃 5. 糖皺褶構象位於 C-2' 內側
Z 形：1. 與 A 形和 B 形不同，Z 形最明顯的區別是它是左手螺旋。2. 糖苷鍵形成由兩個成分組成：嘧啶和嘌呤。反式（對於嘧啶）和順式（對於嘌呤） 3. 每螺旋圈需要 12 個鹼基對 4. 直徑大小約為 18 埃 5. 糖皺褶構象位於 C-2' 內側（對於嘧啶）和 C-3' 內側（對於嘌呤）
DNA 文庫是克隆的 DNA 片段在克隆載體中的集合，可以在其中搜索感興趣的 DNA。如果目標是分離特定的基因序列，則兩種型別的文庫很有用。
基因組DNA文庫是由生物體的基因組DNA製成的。例如，小鼠基因組文庫可以透過使用限制性核酸內切酶消化小鼠核DNA來製成，從而產生大量不同的DNA片段，但所有片段都具有相同的粘性末端。然後將這些DNA片段連線到線性化的質粒載體分子或合適的病毒載體中。這個文庫將包含小鼠的所有核DNA序列，可以用來尋找任何感興趣的特定小鼠基因。文庫中的每個克隆被稱為基因組DNA克隆。並非每個基因組DNA克隆都包含完整的基因，因為在很多情況下，限制性酶會在基因內部至少切斷一次。因此，一些克隆只包含基因的一部分。
cDNA文庫是mRNA的文庫。它由內含子和外顯子構成，cDNA文庫的製作是為了能夠分離基因/基因的最終版本。
cDNA文庫用於篩選菌落。如果要尋找一個基因，可以篩選菌落，使用質粒集合，轉化細菌，並使用探針。還可以使用Southern雜交。透過使用與正在尋找的基因互補的寡核苷酸，最終可以確定哪些細菌菌落具有與質粒中mRNA相對應的DNA。
如何製作cDNA文庫
1. 從細胞中分離mRNA。
2. 使用逆轉錄酶和dNTPss，從原始mRNA建立DNA複製。
3. RNA比DNA更容易降解，因此放入鹼性溶液中降解mRNA。
4. 使用DNA聚合酶完成模板。
最終，得到的是雙鏈DNA，其中一條與mRNA相同。在對所有mRNA完成此操作後，可以將其克隆到質粒中。質粒集合將包含所有mRNA，但以DNA的形式。[1]
- 遺傳資訊儲存：基因組
- 複製：DNA --> DNA
- 轉錄：DNA --> RNA
- 翻譯：RNA --> 蛋白質
- ↑ Viadiu, Hector. "製作cDNA文庫。"UCSD。講座。2012年11月。
http://clem.mscd.edu/~churchcy/BIO3600/bio3600_images/phosphodiester_bonds.htm http://www.science-projects.com/hyperChromic1.htm
Berg，Jeremy。生物化學。第7版。紐約：W.H Freeman and Company，2012。印刷版。
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Berg，Jeremy，Tymoczko J.，Stryer，L.（2012）。蛋白質組成和結構。生物化學（第7版）。W.H. Freeman and Company。ISBN1-4292-2936-5
Hames，David。Hooper，Nigel。生物化學。第三版。紐約。泰勒和弗朗西斯集團。2005年。