結構生物化學/聚合酶鏈式反應/PCR 如何進行

概述

為了進行 PCR，需要多種成分和試劑。首先，需要一個 DNA 模板，該模板包含要擴增的 DNA 區域（目標）。其次，需要與 DNA 目標兩條鏈的 3' 端互補的正向和反向引物。這些引物可以定製設計，並可用於誘導突變。第三，需要鎂 Mg²⁺ 和緩衝液以維持穩定的條件。有時可以使用錳 Mn²⁺ 代替鎂。鎂優於錳，因為更高濃度的錳會增加 DNA 合成過程中的錯誤率。緩衝溶液為 DNA 聚合酶的最佳活性提供合適的化學環境，並保持其穩定性。第四，需要脫氧核苷三磷酸 (dNTP；含有三磷酸基團的核苷酸)，供聚合酶在複製過程中使用。這是 DNA 聚合酶合成新 DNA 鏈的構建模組。最後，需要一種耐熱聚合酶來聚合 DNA。PCR 通常在熱迴圈儀的小反應管中，以 10-200 微升的反應體積進行。熱迴圈儀將反應管加熱和冷卻到 PCR 中每個步驟所需的溫度。它使用珀耳帖效應，該效應透過反轉電流，允許反應管既加熱又冷卻。反應管的薄壁允許快速熱平衡。

用 PCR 成功複製感興趣的 DNA 可能很棘手。這是因為必須非常小心地避免汙染。重要的是確保試劑充分混合並適當地儲存，並根據引物和聚合酶在不同溫度下的敏感性和活性選擇合適的溫度條件。通常，PCR 由通常 20-40 次重複的溫度變化（稱為迴圈）組成，每個迴圈通常包含三個步驟。執行許多迴圈是必要的，因為這樣最終結果將主要由所需的 DNA 組成。每個迴圈中使用的溫度和應用時間取決於用於 DNA 合成的酶、反應中二價離子和 dNTP 的濃度以及引物的熔解溫度。

在將試劑混合在一起放入 PCR 管中（特殊的薄壁 Eppendorf 管，以允許熱量有效傳導）之後，必須對熱迴圈儀進行程式設計，以進行不同的時間、溫度和迴圈。擴增中的每個主要步驟（變性、退火和延伸）都需要與所用引物和聚合酶相適應的不同條件。第一步是初始化步驟。此步驟將反應加熱至 94-98 攝氏度。該溫度保持 1 到 9 分鐘。這種加熱 DNA 會導致 DNA 變性。熱量破壞了將雙鏈 DNA 中的氮鹼基結合在一起的氫鍵，產生單鏈 DNA 分子。第二步是退火步驟，該步驟需要將溫度降低至 50-65 攝氏度，以允許引物與單鏈 DNA 模板退火。退火溫度通常比引物的熔解溫度低 2-3 攝氏度。在退火步驟中，聚合酶與引物-模板雜交體結合並開始 DNA 形成。PCR 的最後一步是延伸步驟。此步驟也發生在特定溫度下，具體取決於所用聚合酶。儘管一些聚合酶在略微不同的溫度下表現更好，但 Taq 聚合酶通常用於 PCR，因此使用該酶時溫度為 72 攝氏度。在此步驟中，DNA 聚合酶透過新增與模板互補的 dNTP 以 5' 到 3' 的方向合成一條新的與 DNA 模板鏈互補的 DNA 鏈，將 dNTP 的 5'-磷酸基團與延伸 DNA 鏈末端的 3'-羥基基團縮合。延伸的持續時間取決於所用的 DNA 聚合酶以及要擴增的 DNA 片段的長度。在最佳溫度下，DNA 聚合酶每分鐘會聚合一千個鹼基。在最後一個 PCR 迴圈之後，需要一個最終延伸步驟來確保任何剩餘的單鏈 DNA 完全延伸。此步驟在 70-74 攝氏度下進行 5-15 分鐘。如果需要，將溫度降低至 4-15 攝氏度，無限期地保持可以允許短時間儲存反應。此外，有些步驟比其他步驟花費的時間更長，並且必須適當地對每個步驟進行計時。一旦建立了合適的條件，就可以設定迴圈次數並執行 PCR。透過這些步驟，DNA 可以方便快捷地擴增。這是因為每個 PCR 迴圈的產物在下一個迴圈中再次用作模板。然後可以對所得 DNA 進行測序以確保準確性，然後透過其他技術（如 Southern 印跡或瓊脂糖凝膠電泳）進行研究。它允許對 PCR 產物進行大小分離。PCR 產物的大小透過與 DNA 梯（分子量標記）比較來確定。此 DNA 梯包含已知大小的 DNA 片段。它與 PCR 產物一起在凝膠上執行，以比較 PCR 產物的大小與 DNA 梯上的大小。

PCR 樣本程式

PCR

將下面所有東西吸移到一個小管中。

40.5 цL H2O
5 цL 5x thermopol buffer
1 цL dNTP mix (10mM)
1.25 цL Forward primer
1.25 цL Reverse primer
+1 цL DNA
=50 цL rxn
+1 цL pfu Turbo polymerase (add at end. keep on ice)

放入熱迴圈儀中（繼續變性、退火和延伸步驟）。

參考文獻