跳轉到內容

結構生物化學/聚合酶鏈反應/PCR 的應用

來自華夏公益教科書,開放書籍,開放世界

PCR 對於科學家來說是一種有用的技術,因為它允許 DNA 的擴增和突變。透過 PCR,少量 DNA 可以被指數級地複製,這不僅在成功的情況下基本上保留了樣本,而且允許更大規模的研究。沒有 PCR,我們能夠分析的樣本和我們能夠誘導和研究的突變將受到我們可用於研究的 DNA 數量的限制。透過 PCR,這種 DNA 基本上是無限的,允許生物化學家對不同基因誘導各種突變以進行進一步研究。

透過定點誘變或定製引物,可以對 DNA 中的單個突變進行。透過改變透過單個突變從 DNA 轉錄的氨基酸,可以分析這些氨基酸相對於基因功能的重要性。但是,這個過程可能很困難,尤其是在基因協同作用的情況下(相對於基因活性而言表達不同)。執行成功 PCR 所需的時間以及在進行研究之前執行其他技術(例如蛋白質表達、分離和純化)的時間,使得生物化學研究既耗時又困難。但是,PCR 與其他生物化學技術相結合,使我們能夠分析生物體的核心以及它們發揮作用的過程。

PCR 是一種可靠的方法,可以檢測與遺傳疾病相關的所有突變,從插入到缺失等等。它也可以用來檢測不需要的遺傳物質的存在,如感染和細菌。例如,在診斷艾滋病等疾病時,PCR 可用於檢測感染 HIV 的少量細胞。PCR 還允許早期診斷諸如白血病等不需要的疾病。PCR 提供了一種非常簡單快捷的替代方法。

研究中的 PCR 例子

[編輯 | 編輯原始碼]
由 Nisha Patel,UCSD 兒科,Sander 實驗室執行的 PCR

PCR 是一種高度常用且廣泛用於研究的工具,它允許研究人員透過簡單的反應來擴增 DNA 片段,這些反應可以在一小時內完成。研究中的 PCR 最常用於測試體內基因表達。這些例子包括小鼠 DNA 的 PCR,以確定小鼠攜帶的基因。可以對這些帶有特定靶基因的小鼠進行研究,以觀察這些基因的生物學效應。當今實驗室中常見的 PCR 協議包括敲除基因分型、熒光基因分型和突變基因分型。研究人員可以使用 PCR 作為一種搜尋基因的方法,方法是使用 flanking 目標基因序列的引物以及 PCR 所需的所有其他組分。如果基因存在,引物將結合並擴增 DNA,在將要執行的瓊脂糖凝膠上產生擴增 DNA 帶。如果基因不存在,引物將不會退火,也不會發生擴增。擴增可以在 DNA 中的多個位置發生,這就是為什麼研究人員可以使用 DNA 梯子來比較擴增鏈的相對長度(通常以 bp 為單位)。如果基因的長度已知,那麼研究人員將知道要尋找哪些帶以及可能忽略哪些帶。使用“可能忽略”一詞是因為 PCR 通常與正在研究的 DNA 以及對照一起執行,對照可以包括基因陽性的 DNA、基因陰性的 DNA 以及除 DNA 之外的 PCR 反應中的所有反應物。如果在 DNA 陰性和僅反應物反應中以及所有其他反應中都存在基因陽性帶,則理解一些反應物被陽性 DNA 汙染,因此應將其丟棄並重新執行 PCR。

這是一個使用 PCR 反應產物執行的凝膠的示例。最左側的列是 100bp 梯子,它跟蹤 100、200、300 等鹼基對片段的移動。每個孔代表從一隻小鼠身上提取的 DNA。如圖片所示,一些小鼠缺少一種會被引物擴增的 DNA 序列。在這裡可以看到 PCR 在識別小鼠中針對 DNA 的靶序列方面的強大工具。由於可以區分不同遺傳背景的小鼠,因此可以對某些基因做出進一步的結論。

PCR 應用

[編輯 | 編輯原始碼]

PCR 可用於分離基因組 DNA。這意味著 PCR 可以透過擴增親本 DNA 鏈的特定區域來從基因組 DNA 中分離 DNA 片段。PCR 的應用包括生成用於 Southern 和 Northern 雜交、DNA 克隆、DNA 測序、遺傳指紋等雜交探針。

法醫學個人的 DNA 圖譜非常獨特。多個基因的 PCR 擴增正在用於在親子鑑定案件中確定生物學親子關係。透過 PCR 分析血跡和精液樣本已經確定了大量襲擊和強姦案件中的罪責或無罪。在犯罪現場發現的單個脫落毛髮或皮膚的根部包含足夠的 DNA,可以透過 PCR 進行分型。PCR 的強大之處在於,該過程只需要很少的 DNA 鏈,因為擴增以指數級進行。PCR 也不需要了解目標 DNA 序列,而只需要瞭解 flanking DNA 序列。

進化論由於 DNA 的穩定性,大量的 DNA 片段可以儲存數千年。因此,PCR 是將古代 DNA 分子擴增用於進化研究的理想選擇。PCR 還可用於擴增尚未分離的微生物的 DNA。

PCR 擴增

[編輯 | 編輯原始碼]

PCR 可以分析極少量的 DNA 樣本,並可以擴增 DNA 的目標區域。

定量 PCR

[編輯 | 編輯原始碼]

定量 PCR 是一種可以估計樣本中將顯示的序列量的方法;這通常用於定量確定基因表達水平。即時 PCR 是一種用於 DNA 定量的工具,它在每個 PCR 擴增迴圈後測量 DNA 產物。

PCR 用於診斷疾病

[編輯 | 編輯原始碼]

惡性腫瘤(如白血病)的 PCR 診斷在癌症研究中被常規使用。當直接在基因組 DNA 上進行時,PCR 檢測可以比任何其他方法檢測到更高的惡性細胞。該技術可以識別某些生長控制基因(如 ras 基因)的突變。能夠極大地擴增 DNA 的選定區域在監測癌症化療中也具有很高的資訊量。PCR 測試可以檢測出癌細胞何時被消除,以及檢測復發。

PCR 可以揭示那些尚未對這種病原體產生免疫反應的人體內是否存在人類免疫缺陷病毒(否則會透過抗體檢測錯過)。

在組織樣本中發現結核分枝桿菌緩慢且費力,但使用 PCR,每百萬個人類細胞中只有 10 個結核桿菌就可以很容易地檢測到。

華夏公益教科書