結構生物化學/蛋白質/蛋白質結構測定方法
有許多方法可以用來確定蛋白質的結構。
X射線晶體學是一種實驗技術，用於確定分子的結構。X射線晶體學之所以有效，是因為用於研究樣品的X射線輻射的波長足夠短，能夠識別分子的特徵。將感興趣的樣本分離、純化並結晶，然後用X射線束照射晶體樣本。X射線光子的路徑根據構成晶體結構的分子結構而發生擾動，X射線路徑被捕獲在晶體樣本後面的感光紙上。分析X射線在感光紙上形成的圖案，可以推斷出分子的結構。
由於X射線晶體學和核磁共振需要大量（約毫克級）的純化蛋白質（在當前的純化技術中，由於複雜性，通常無法獲得）來分析蛋白質的結構，因此通常採用重組技術，透過操縱宿主生物體表達要研究的蛋白質。通常，需要使用蛋白質重摺疊方法，因為蛋白質不能正確摺疊，並且蛋白質結構中會發生稱為包涵體的異常情況。為了獲得正確摺疊的蛋白質，必須去除異常情況；將蛋白質變性然後重摺疊到其正確的結構。因此，可以利用X射線晶體學或核磁共振研究重摺疊的蛋白質。已知蛋白質的結構和功能分析證實，該方法與直接從其天然來源研究蛋白質相當。
將蛋白質溶液置於磁場中，並測量不同射頻對蛋白質中不同原子共振的影響。蛋白質必須小（~120個殘基）且必須可溶才能使用這種方法。從頭算方法、同源建模和摺疊識別也是用於確定蛋白質三級結構的其他常用方法。
這種方法可以在液氮溫度或低於液氮溫度下進行，可以建立視覺化效果。它是一種相當新的技術，可以以極高的解析度建立視覺化效果。該方法是一種電子顯微鏡形式，利用極低的溫度來減少標本輻射損傷的發生。
從頭算方法用於從第一性原理預測蛋白質的三級結構。它基於熱力學假設，該假設預測蛋白質的天然構象對應於蛋白質/溶劑系統的全域性自由能最小值。同源建模是一類從氨基酸序列構建蛋白質原子解析度模型的方法。它的動機是，如果序列相似性很高，那麼結構相似性也可能很高。幾乎所有同源建模技術都依賴於識別一個或多個可能與查詢序列結構相似的已知蛋白質結構，以及生成將查詢序列中的殘基對映到模板序列中的殘基的對齊方式。然後使用序列比對和模板結構來生成目標的結構模型。由於蛋白質結構比DNA序列更保守，因此可檢測到的序列相似性水平通常意味著顯著的結構相似性。
硬X射線熒光（XRF）顯微鏡是一種強大的結構視覺化方法。它檢測生物系統中金屬分佈的痕跡，如Cu和Zn。它可以同時對映10-15種元素，從而生成準確的元素共定點陣圖。微量元素對大多數生命形式都很重要。金屬透過催化功能或結構作用在許多蛋白質中發揮著重要作用。金屬也被認為會影響人類健康和疾病。
X射線熒光適用於定量分析微量元素。X射線熒光可以透過X射線束或透過暴露於質子或電子等粒子來激發。這有助於以高空間解析度對映元素含量。X射線微探針具有區域板、Kirkpatrick-Baez 鏡、複合折射透鏡和錐形毛細管，具有不同的探針尺寸和光強度。
斷層掃描（稱為切片成像）是一種二維技術，對許多相鄰切片一起進行，從而形成三維重建。XRF還使用了全場成像和結構檢測方法。這些技術具有混合優勢和劣勢，具有不同的空間解析度、靈敏度和不同的元素對比度。投影斷層掃描使用標本的投影作為斷層掃描重建演算法的輸入資料。但是，X射線熒光顯微照片並不完全等同於投影成像，因為存在自吸收效應，包括入射光束的吸收和熒光的重新吸收。較厚的生物組織中的較重金屬已成功地使用背投影而無需校正。共聚焦斷層掃描是一種直接空間方法，用於掃描XRF斷層掃描，軸向解析度達到5微米以下。準直器或透鏡限制了能量色散檢測器的視場，因此訊號僅來自照射柱的小部分。然後將探針體積減小到球體，並透過在三個維度上掃描標本穿過探針體積來對映元素分佈。共聚焦幾何結構也允許直接訪問標本的小區域；但是，針對感興趣的特徵可能非常困難。
自吸收在XRF斷層掃描中起著重要作用，因此需要良好的校正演算法以確保影像保真度，以擴充套件標本尺寸域，擴充套件元素域並保持定量資料精度。
在軟 X 射線斷層掃描中，樣品的投影影像是在圍繞旋轉或“傾斜”軸的不同角度收集的，這在數學上能夠被計算以重建樣品。在三維斷層掃描中遇到的一個問題是，生物材料在暴露於 X 射線顯微鏡中的強光（來自光子或熒光顯微鏡中的紫外線照射）時會受到損壞。然而，在軟 X 射線斷層掃描中，影像集合以 1-2 度的增量在 180 度旋轉中獲取。這會導致樣品因接收大量輻射而發生結構性損壞。然而，樣品的冷凍固定避免了這個問題。當細胞在液氮溫度下成像時，可以收集超過一千張軟 X 射線投影影像，而沒有明顯的輻射損傷跡象。
水窗軟 X 射線斷層掃描的主要優勢在於它可以應用於細胞生物學中的任何成像研究，例如成像簡單的細菌、酵母和藻類、高階真核細胞和組織。這些影像還保持真核細胞處於原始狀態，無需使用染色劑或標記物，這是光學顯微鏡或電子顯微鏡無法做到的。
電子斷層掃描，也稱為 ET，是一種新型的視覺化技術，它可以做到其他結構測定方法無法做到的事情，即這種方法能夠彌合超分子結構的原子結構資訊與其細胞事件之間的差距。它不僅可以視覺化分子的結構，還可以視覺化它與其他結構和細胞器的關聯。例如，電子斷層掃描為觀察病毒在宿主細胞中的傳播和病毒生命週期打開了大門。斷層掃描切片可以檢查病毒附著到細胞、穿透細胞、移動到複製位點、組裝子代病毒並將其運送到膜區域以及從細胞中出來的分子結構。雖然這項技術仍然很新，但它已經應用於人類和猴免疫缺陷病毒（HIV 和 SIV）以及感染植物、動物和人類的其他病毒。
以下是透過使用電子斷層掃描觀察和闡明的細胞事件的示例。
1) 病毒進入：ET 顯示存在“進入爪”，這是病毒與宿主細胞接觸的特徵結構。進入爪由五到七根杆組成，代表了病毒刺突與細胞表面受體之間的相互作用。此外，CT 顯示，一些細胞，例如痘苗病毒感染的細胞，在細胞入侵前後顯示出痘苗病毒形狀的明顯變化。
2) 病毒工廠：ET 揭示了更多關於病毒顆粒的知識，病毒顆粒是位於病毒複製位點的包涵體，負責病毒組裝和複製。ET 支援了在病毒顆粒內部發現核心蛋白 P1、P3、P5 和 P7 以及外部衣殼蛋白 P2、P8 和 P9，以及病毒顆粒圍繞病毒顆粒的形成。有了這些資訊，科學家能夠提出一個三步病毒複製過程：1) 在病毒顆粒內部形成核心顆粒，2) 核心顆粒在病毒顆粒周邊用外部衣殼包被，以及 3) 透過微管將成熟的病毒運輸到膜區域。
3) 病毒顆粒在細胞內的運輸：提出的病毒複製過程的第三步透過 ET 觀察並得到證實。病毒在初始位點傳播後，會移動到另一個位點進行二次繁殖。這種向另一個位點的移動是透過病毒利用絲狀物質（如由肌動蛋白和 β 微管蛋白組成的微絲和微管 (MT)）發生的。ET 允許視覺化胞質運輸機制，並強烈暗示微管有助於將新組裝的病毒運輸到膜，從而導致病毒在細胞之間的傳播。這表明微管有助於細胞之間的傳播，而不是病毒進入複製位點。最後，ET 顯示了病毒和微管之間的間隙，表明病毒顆粒不直接與微管相互作用。相反，間隙中充滿了桿狀結構，該結構可能充當正端定向馬達。
總之，ET 顯示出比其他結構測定方法具有兩方面的優勢。首先，ET 可以防止基於二維結構的誤導性結論。其次，觀察細胞和病毒中更精細的結構可以闡明病毒顆粒在與微管相關的詳細組織。這隻有使用 ET 才能觀察到。
在軟 X 射線顯微鏡中，第三代同步加速器用作 X 射線源。軟 X 射線投影影像是由精密奈米結構 X 射線透鏡、高效直接檢測 CCD 相機以及設計良好的透射 X 射線顯微鏡產生的。影像使用相位對比技術生成。
軟 X 射線顯微鏡使用能量處於“水窗”範圍內的光子進行操作，該範圍是位於碳和氧的 K 層吸收邊之間的光譜區域。細胞水保持透明，因為細胞中的結構根據生化成分和密度進行視覺化。脂滴是比水含量高的細胞器（如液泡）吸收更多光的結構。
病毒感染細胞超分子結構的電子斷層掃描。巖崎健二和大村利浩。
- ↑ Hiller, S., Abramson, J., Mannella, C., Wagner, G., and Zeth, K., "The 3D structures of VDAC represent a native conformation," Trends in Biochemical Sciences, 2010.