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凝膠過濾柱

凝膠過濾色譜，也稱為 '尺寸排阻色譜'，'分子排阻色譜' 或 '分子篩色譜' 是一種最簡單、最溫和的技術，它根據分子大小差異（流體力學體積）分離分子。這種方法允許透過將凝膠過濾介質填充到色譜柱中，將每種多肽從其他不同大小的多肽中分離出來。與離子交換或親和色譜不同，透過色譜柱的餾分不與色譜介質結合。凝膠過濾色譜的優點是，介質可以根據樣品的性質進行變化，以進行進一步的純化。

當使用有機溶劑作為流動相時，化學家往往將其稱為凝膠滲透色譜。用作流動相的緩衝液或有機溶劑的選擇基於特定蛋白質樣品的化學和物理性質。色譜柱的固定相只是碳水化合物聚合物珠，流動相以不同的速度穿過固定相，這取決於分子的尺寸。該技術用於分析有機溶解聚合物的摩爾質量分佈。它是由 Grant Henry Lathe 和 Colin Ruthren 發明的，他們當時在英國倫敦的皇后夏洛特醫院工作。

凝膠過濾色譜可以以兩種不同的方式應用：組分離和生物分子的高解析度分離。組分離技術根據尺寸範圍將樣品中的化合物分成組。該技術用於從高或低重量汙染物中純化樣品。生物分子的高解析度分離是一種更精確的技術。它可用於分離樣品中的一種或多種組分，分離單體和聚集體，確定分子量，或進行分子量分佈分析。凝膠過濾色譜非常適合對 pH 變化、金屬離子濃度或輔因子非常敏感的生物分子。

在透過凝膠過濾色譜分離並由色譜柱中特定孔徑的珠子分離的分子尺寸範圍內，物質的相對洗脫體積（即發現該分子的餾分的體積）與它的分子量的對數呈線性關係（假設分子具有相似的形狀）。如果使用已知分子量的幾種蛋白質對給定的凝膠過濾柱進行校準，則可以透過未知蛋白質的洗脫位置來估計其質量。

類比

理解凝膠過濾工作原理的一個類比（這是概念性的，與 ME 色譜中的實際情況甚至沒有一點關係）是想象幾個彈球（或海綿或瑞士乳酪——任何能容納你的東西）懸浮在一個玻璃罐中。現在想象一下，你有一個裝滿沙子、小彈珠和高爾夫球的桶；你把它倒進去。當你觀察時，首先高爾夫球到達水箱的底部，然後是彈珠，最後是一層沙子沉澱下來。為什麼？基本上，所有的沙子都進入了彈球（或瑞士乳酪或海綿）的洞中，它往往從一個彈球的內部掉到另一個彈球的內部，大大減緩了沙子到達水箱底部的速度。彈珠只比彈球的洞小一點，所以它們有時會掉進洞裡，但有時也會彈出來；同樣，彈球會減緩它們的速度，但程度較小。高爾夫球太大，不適合彈球的洞，所以它們直接穿過彈球——最快最直接的路線。關鍵：沙子=小分子；彈珠=中分子；高爾夫球=大分子；彈球=多孔珠子；水箱=色譜柱和水溶液

一般程式

填充在色譜柱中的凝膠介質是一種多孔基質，由球形珠子組成，這些珠子具有穩定的物理和化學性質，如無反應性和無吸附。小分子可以進入珠子，但大分子不能。小分子在珠子內部和珠子之間水溶液中分佈，而大分子位於珠子之間的溶液中。這些珠子不溶，通常由高度水合的聚合物製成，如葡聚糖、瓊脂糖或聚丙烯醯胺。出於商業目的，使用 Sephadex、Sepharose 和 Biogel。這些商業珠子直徑約為 100 微米，用於根據大小分離蛋白質。此外，二氧化矽或交聯聚苯乙烯也可以在更高的壓力下用作珠子的材料。顆粒之間的孔隙和空間充滿液體緩衝液，該緩衝液填充整個色譜柱。填充孔隙空間的液體稱為固定相，顆粒間空間的液體稱為流動相。一旦樣品被施加到色譜柱的頂部，它就會與流動相一起從色譜柱的頂部到底部穿過色譜柱。較小的分子能夠穿過並穿過這些聚合物珠子，但較大的分子則不能。因此，色譜柱中小分子既存在於聚合物珠子內部，也存在於珠子之間，而大分子只能在聚合物珠子之間移動。由於較大的珠子允許的移動空間較小，因此它們往往會更快地向下移動色譜柱，並且首先在色譜柱的末端出現。想想這個。沿著色譜柱移動的分子代表一個水龍頭。如果水龍頭允許水的移動空間較小，水將更快地流出，並以更大的力量流出。這裡也適用相同的概念。由於較大分子可訪問的體積較小，因此它們比較小的分子在色譜柱中移動得快得多。因此，由於小分子被困在珠子內部，它們往往移動得更慢。理論上，尺寸相同的分子應同時洗脫。可以構建洗脫圖或色譜圖來驗證完全分離。在分離未知樣品之前，可以執行具有已知生物分子的溶液以製作校準曲線，該校準曲線稍後可作為識別未知分子的參考。

利用

凝膠過濾色譜通常用於分析合成和生物聚合物，如核酸、蛋白質和多糖。該技術的缺點是固定相也可能以不良方式與分子相互作用，從而影響其保留時間。該方法的主要缺點是難以產生高解析度影像。一種替代方法可能是間斷電泳。盤式電泳使用具有不同 pH 值的凝膠，當蛋白質從一種凝膠移動到另一種凝膠時，蛋白質會產生清晰的條帶，從而建立高解析度影像。 該技術需要三種不同的凝膠：樣品凝膠、堆積凝膠和執行凝膠。蛋白質在進入樣品凝膠和執行凝膠之間移動，穿過堆積凝膠，然後蛋白質進入這些凝膠。這會壓縮蛋白質並提高解析度。

凝膠過濾色譜不應與凝膠電泳混淆，在凝膠電泳中，施加電流以產生電場，根據其電荷將分子透過凝膠分離到電極（陽極和陰極）。此外，在凝膠過濾色譜中，大分子首先遷移到色譜柱底部，而在凝膠電泳中，小分子首先遷移到凝膠底部。

參考文獻

Viadiu，Hector。生物化學 114A 講座。“蛋白質技術”。2012 年 10 月 15 日