結構生物化學/蛋白質/純化/高效液相色譜
高效液相色譜（也稱為高效液相色譜，或簡稱HPLC）是柱色譜的一種增強形式，通常用於生物化學中分離和純化複合樣品。與其他色譜方法中溶劑由於重力而滴落透過色譜柱不同，溶劑在高壓下被推入色譜柱。
HPLC 的柱填料更均勻，並且更細緻，因此有更多的相互作用機會，並具有更高的分離（分離）能力。由於柱由更高質量的材料製成，因此必須對色譜柱施加恆定壓力才能獲得可接受的流速。因此，最終結果是高解析度和非常快的分離。
HPLC 在 1970 年代中期隨著新柱技術的開發和改進而發展，取代了其他原始的柱色譜技術，這些技術在定量和純化類似化合物時失敗了。壓力液相色譜法被證明比舊方法耗時更少。與經典的柱色譜法相比，經典的柱色譜法依靠重力驅動色譜柱，分離可能需要數小時甚至數天時間，而 HPLC 能夠在五到三十分鐘內完成。
到 1980 年代，HPLC 被廣泛用於化合物純化。計算機和其他改進的技術提高了 HPLC 的便利性。HPLC 中柱型別以及隨之而來的重現性的改進，導致了微柱、親和柱和快速 HPLC 的發展。
過去十年見證了微柱開發的巨大進步，微柱現在被廣泛用於 HPLC 和其他專門色譜柱。典型的 HPLC 色譜柱的直徑約為 3-5 毫米。但微柱或毛細管柱的典型直徑範圍為 3 µm 至 200 µm，因此要小得多。快速 HPLC 使用的色譜柱比典型色譜柱短，因此它們填充了更小的顆粒。
如今，人們可以選擇多種型別的色譜柱用於分離混合物，以及各種檢測器與 HPLC 配合使用，以獲得最佳的化合物分析結果。
將一小部分樣品放入高效液相色譜中，流動相將使其透過固定相。流動相通常是氣體或液體，而固定相是固定且不溶的。固定相會因其物理或化學性質（尺寸、淨電荷或其他差異，具體取決於 HPLC 型別）而減慢樣品的流動速度，在此過程中樣品將被過濾或純化。由於固定相對雜質與所需化合物的影響不同，樣品的不同組分將在不同的時間出來。組分從色譜柱中出來的時間稱為保留時間。保留時間應該對特定樣品中的組分是唯一的，因此分析的兩個組分不會在同一時間洗脫並相互掩蓋。如果溶劑組成無法調整以有效地分離 HPLC 分析中的組分，則其他型別的色譜可能更合適。與其他柱色譜技術不同，HPLC 使用泵施加壓力將組分推過填充更細密的色譜柱，以加快分析速度，並能夠分析在自身條件下洗脫時間更長的組分和色譜柱組合。
流動相是一種溶劑或混合溶劑，它將樣品帶過固定相。當流動相透過固定相時，樣品組分與柱材料之間的分子相互作用決定了不同組分的保留時間。與色譜柱相比，與流動相具有更強相互作用的組分將“偏愛”流動相，並以更短的保留時間更快地洗脫，而與溶劑相比，與固定相具有更強相互作用的組分將“偏愛”色譜柱，並以更長的保留時間更慢地洗脫。這就是 HPLC 如何分離、過濾並幫助純化化合物的原理。關於流動相，有不同的技術被調整以最佳化保留時間、分離和峰值清晰度。這些是等度、梯度和多型。
等度洗脫涉及恆定的流動相組成。例如，對於反相高效液相色譜（RP-HPLC）執行，流動相為 50% 乙腈和 50% 水，在整個分析過程中保持不變。選擇一個溶劑系統，並在整個 HPLC 執行過程中使用它。樣品在流動相流過時被注射，以恆定的流速進入 HPLC，並透過所選色譜柱。這種方法通常用於分析的樣品足夠簡單，以至於樣品的所有組分在不同的時間以足夠的清晰度出來，並且沒有過長的保留時間。
大多數樣品並不那麼容易處理。在這種情況下，將設定梯度洗脫方法。流動相混合物將在執行過程中發生變化，並且溶劑的濃度將被修改，以便執行從“較弱”的溶劑開始，而“較強”的溶劑將在結束時濃度最高。一個例子是反相高效液相色譜執行，它從更多流動相 A 開始，流動相 A 由 95% 水和 5% 乙腈混合而成，並將逐漸增加流動相 B，流動相 B 是 100% 乙腈混合物，直到執行結束時，流過色譜柱的大部分流動相都是流動相 B。通常對於反相高效液相色譜，流動相將從極性更強的溶劑組合開始，並在執行過程中增加極性更弱的溶劑組合的濃度。這樣，非極性分子（相對於所使用的流動相和固定相）最終會由於非極性溶劑濃度較高而洗脫，並且分析所需的執行時間可以縮短。等度流動相的極性可能與固定相太接近，導致組分立即一起洗脫，並且它們的峰重疊，或者與非極性固定相的極性相差太大，導致非極性組分洗脫時間過長。這就是為什麼梯度流動相經常用於分析的原因，其中可以修改非極性溶劑到極性更強的溶劑的濃度，以獲得最佳的峰分離。
多型洗脫，也稱為混合模式色譜，涉及使用一種特殊的色譜柱，該色譜柱可以根據溶劑切換分析模式。同一個色譜柱可以根據流過它的溶劑型別執行尺寸排阻、離子交換或親和色譜。
保留時間取決於樣品組分、流動相和固定相之間的相互作用。因此，設計良好的 HPLC 執行依賴於選擇適合所需分析的色譜柱型別以及適合分析物和色譜柱的流動相組合。
色譜柱效率描述了固定相過濾或純化的效果，基本上是它的填充程度以及物質在其上的移動效果。有幾種方法可以衡量色譜柱效率，但它們都使用相同的公式
N=atr2/W2
N=理論塔板數
a=取決於圖高度的常數
tr=保留時間
W=峰寬
正相色譜或NP-HPLC是第一種開發的 HPLC。在這種方法中，使用極性固定相和非極性流動相來分離基於極性的分析物。由於極性相是固定相，極性分析物將與該相結合。它們的吸附強度和洗脫時間取決於分析物極性和分析物空間因素的強度。由於洗脫時間取決於空間碰撞，因此可以區分和分離結構異構體，因為每個異構體具有不同的空間碰撞。可以透過在非極性流動相中新增非極性溶劑來增加洗脫時間。也可以透過在非極性流動相中新增極性物質，甚至佔據固定相表面，阻止極性分析物與極性表面結合，從而減少分析物的保留時間。
過去，這種方法不受歡迎，因為水或質子有機溶劑會改變系統中介質的水合狀態。然而，這個問題在NP-HPLC的另一種版本親水相互作用液相色譜中得到了解決，該版本使用具有更好保留時間的多種相。
反相色譜顧名思義，與正相色譜相反，它具有非極性固定相和極性流動相。因此，非極性分析物將與非極性相結合，其洗脫時間也將取決於其非極性程度。也可以透過在流動相中新增極性溶劑來增加洗脫時間，或者透過在同一相中新增非極性溶劑來減少洗脫時間。然而，與 NP-HPLC 不同，該方法依賴於疏水相互作用。
一些因素會影響疏水相互作用。其中一個因素是表面積。具有較大疏水錶面積的分析物將具有更長的保留時間，因為分析物與非極性表面之間會有更多鍵相互作用。然而，過大的分析物表面將無法進入非極性相的孔隙，並且不會與該相發生任何相互作用。這種鍵強度的增強也是由於水對分析物周圍的“空腔減少”力的作用，在這個過程中釋放的能量取決於洗脫液的表面張力，在本例中是水。
另一個可能影響疏水相互作用的因素是 pH 值。理想的環境是不帶電荷的環境。因此，化學家使用緩衝劑（如磷酸鈉）來調節 pH 值並中和固定相上通常由二氧化矽組成的暴露介質上的電荷以及分析物上的電荷。
反相色譜柱比普通二氧化矽色譜柱更強，但仍有一些缺點。鹼性水溶液不應與由烷基衍化的二氧化矽顆粒組成的色譜柱一起使用，因為鹼性將破壞下面的二氧化矽顆粒。此外，如果使用含水酸，則應避免長時間暴露在色譜柱上，以防止腐蝕。
凝膠過濾色譜根據蛋白質大小的不同進行分離。該過程涉及將裝滿緩衝液的凝膠裝入色譜柱中。該凝膠具有許多多孔的碳水化合物聚合物珠狀顆粒。孔的大小選擇使得它只能允許特定尺寸的蛋白質擴散透過。那些足夠小可以進入珠子孔隙的分子，由於被迫進入色譜柱的固定相，因此它們的移動速度會變慢。另一方面，較大的分子由於無法進入珠子的內部體積，最終會更快地穿過色譜柱。
凝膠過濾色譜最重要的優點是它能夠以原始的非變性狀態分離蛋白質，為您提供適合進一步分析的樣品。另一個優點是在色譜柱中施加壓力以獲得足夠的流速，從而獲得高解析度。更慢的流速可以實現更高的解析度。對於大多數凝膠，推薦的蛋白質分離最佳流速約為 5mL/cm2/h。
參考文獻：Aguilar，Marie-Isabel。肽和蛋白質的 HPLC 方法和協議。第 251 卷。Humana Press。
離子交換色譜根據蛋白質的電荷進行分離。它足夠有效，可以分離僅在單個帶電基團上不同的蛋白質。它取決於蛋白質上的帶電基團與色譜柱中帶有相反電荷的離子交換凝膠之間形成離子鍵。不帶電荷的中性蛋白質透過洗滌去除。然而，那些可以形成離子鍵的蛋白質透過使用更高離子強度的緩衝液或改變 pH 值進行洗脫來回收。相反電荷離子（被分析蛋白質的離子與凝膠介質的離子）的增加會增加保留時間，這基於蛋白質離子與凝膠介質中帶電離子之間的吸引力。
離子交換劑有兩種型別。一種是陰離子交換劑，它在凝膠介質中具有正電荷基團，這些基團是固定的，並且會與蛋白質中的負電荷離子相互作用並結合。另一種是陽離子交換劑，它在凝膠介質中也具有負電荷基團，但會與蛋白質中的正電荷離子相互作用並結合。
溶液的 pH 值也會改變蛋白質離子與凝膠介質中離子之間的電離過程。當 pH 值等於蛋白質的等電點（淨電荷為零的點）時。然而，當 pH 值小於等電點時，蛋白質上的淨電荷將為正，並且它將與陽離子交換劑結合。最後，如果 pH 值大於等電點，蛋白質上的淨電荷將為負，並且它將與陰離子交換劑結合。因此，透過控制溶液的 pH 值，我們可以控制蛋白質的分離方式，因為正是這些交換劑分離了蛋白質。
參考文獻：Aguilar，Marie-Isabel。肽和蛋白質的 HPLC 方法和協議。第 251 卷。Humana Press。
親和色譜是一種分離生物化學混合物的方法，基於高度特異的生物相互作用。它用於從混合物中純化分子並將其濃縮到緩衝溶液中，以及識別哪些生物化合物與其他分子（如藥物）結合。它是由 Pedro Cuatrecasas 和 Meir Wilcheck 在 1968 年發現的。
該過程涉及將要從混合物中分離的目標蛋白質（或分子）捕獲到固體或介質上。色譜柱中裝滿了含有共價葡萄糖殘基的珠子，選擇這些殘基與目標蛋白質相對應。蛋白質在倒入色譜柱時會穿過珠子，當識別出目標蛋白質時，它會由於對葡萄糖的親和力而透過共價鍵被捕獲到色譜柱上。其餘蛋白質將流出色譜柱併成功分離。將一部分緩衝液新增到色譜柱中以洗掉未結合的蛋白質。最後，新增濃縮的葡萄糖溶液以將目標蛋白質從與色譜柱連線的葡萄糖殘基中分離出來，從而使蛋白質完全從混合物中純化出來。
吸附色譜
吸附是指溶質在固體或液體表面積累的現象。色譜法利用溶質極性差異進行分離混合溶質。其原理是極性溶質與極性固定相形成更強的鍵合，而非極性溶質則形成較弱的鍵合。將不溶性極性物質，如矽膠（二氧化矽的衍生物，Si(OH)¬4），填充到玻璃柱中，形成固定相。樣品中包含的混合物是流動相，可以是液體或氣體，將其倒入玻璃柱中，不同極性的溶質將在柱中與固定相以不同的方式結合。極性溶質將牢固地結合到固定相，而非極性溶質將結合得更鬆散，中性溶質將直接透過柱體。溶質可以用極性逐漸升高的溶劑洗脫，洗脫順序與極性增加一致。因此，中性溶質將直接透過柱體，而非極性溶質將首先洗脫，而極性溶質將最後洗脫。
參考文獻：生物化學原理 第4版. Nelson, David L.; Cox,Michael M.W.H Freeman and Company. New York
- 實用高效液相色譜法開發 第2版. Snyder, Lloyd R.; Kirkland, Joseph Jack; Glajch, Joseph L. New York.
- 高效液相色譜法藥物分析手冊. M. W. Dong. Elsevier.