結構生物化學/蛋白質/純化/SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳

SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳是一種根據電泳遷移率分離蛋白質的技術,電泳遷移率是多肽鏈長度或蛋白質質量的函式。SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳也可用於分離 DNA 和 RNA 分子。
SDS 代表十二烷基硫酸鈉。“SDS 是一種陰離子去汙劑,會破壞天然蛋白質中的非共價相互作用。”SDS 用於創造變性條件以根據分子量分離蛋白質,並且還會根據其質量賦予蛋白質負電荷。透過使用 SDS 使蛋白質變性,蛋白質可以僅根據其質量分離;沒有 SDS,其他分子特性,如電荷和形狀,會干擾分離過程(例如,沒有 SDS,強負電荷的蛋白質會更快地向下移動凝膠,即使它們更大)。此外,還會引入一種載入染料,有助於將蛋白質結合到凝膠上,並在用紫外光照射時使其更容易識別。
SDS-PAGE 透過 SDS 陰離子與多肽主鏈結合,每兩個氨基酸殘基結合一個 SDS 陰離子,來估計解離的多肽的質量。SDS-PAGE 與沉降平衡技術不同,因為 SDS-PAGE 使用蛋白質變性來進行質量測定。
該技術用於測試目標蛋白質的純度以及樣品溶液中目標蛋白質的百分比。與凝膠電泳相比,該技術快速、靈敏且具有高解析度,因為它可以用考馬斯亮藍染色時僅 0.1 微克的蛋白質產生明顯的條帶,並且相差 2% 的蛋白質仍然可以分離。
SDS-PAGE 也可以與等電聚焦相結合,以獲得非常高的解析度分離。首先根據蛋白質的淨電荷對其進行分離,然後在過濾隔室旁邊同時進行 SDS-PAGE。
洗滌劑廣泛用於中斷疏水相互作用,這進而可以破壞脂質雙層。洗滌劑是用於溶解跨膜蛋白的最常見型別的試劑。
洗滌劑是小的兩親分子,比脂質更容易溶於水。有時它們的親水頭(極性側)可以帶電荷,如 SDS,但可以是非離子型的,如辛基葡萄糖苷和 Triton。洗滌劑在低濃度下呈單體形式,但在高濃度下形成膠束,克服臨界膠束濃度後。為了使洗滌劑單體濃度保持恆定,單個洗滌劑進出膠束。洗滌劑對條件非常敏感,因為它們取決於 pH 值、鹽濃度和溫度。因此,洗滌劑非常複雜,難以研究。
洗滌劑透過充當替代品來幫助破壞脂質雙層。當洗滌劑與脂質混合時,洗滌劑的疏水部分附著在脂質雙層的疏水頭上,使它們可溶。如果洗滌劑濃度降低,蛋白質將無法保持可溶。如果引入更多磷脂,膜蛋白會形成脂質體。由於洗滌劑的另一側是極性的,因此結合會將膜蛋白作為洗滌劑-蛋白質複合物帶入溶液中。從這個意義上講,洗滌劑充當脂質膜的膠囊/替代品。
SDS 是一種強離子型洗滌劑,可以透過攻擊疏水核心本身來溶解最疏水的膜蛋白,這最終會使蛋白質變性,並且可以在稱為 SDS 聚丙烯醯胺凝膠電泳的程式中使用。由於蛋白質變性,對蛋白質功能的研究似乎幾乎是無稽之談,但研究表明,一旦去除洗滌劑,蛋白質就可以恢復天然狀態。如今,洗滌劑在商業上用於去除汙漬或汙染衣物的蛋白質。透過使蛋白質可溶,它能夠從衣物中去除直接和間接的其他蛋白質。
與 SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳類似,藍天然聚丙烯醯胺凝膠電泳是另一種有用的蛋白質純化方法,它使科學家能夠分析線粒體、葉綠體、微粒體和細菌中的膜蛋白複合物。[1]
http://www.molecularstation.com/sds-page-gel-electrophoresis/#definition
"生物化學。第六版 - Jeremy M. Berg、John L. Tymoczko Lubert Stryer"
"細胞的分子生物學。第五版 - Alberts、Johnson、Lewis、Raff、Roberts、Walter"