結構生物化學/蛋白質/純化/鹽析

簡介

"鹽析"過程是一種純化方法，它依賴於蛋白質溶解度的基礎。它依賴於大多數蛋白質在高鹽濃度溶液中溶解度較低的原理，因為新增鹽離子會遮蔽帶有多個離子電荷的蛋白質。這些電荷有助於蛋白質分子相互作用、聚集並沉澱。導致沉澱的確切濃度因蛋白質而異，從而允許分離不同的蛋白質（因為蛋白質在鹽濃度增加時將在不同的點沉澱）。鹽析還可以濃縮稀釋的蛋白質溶液；一旦蛋白質沉澱，就可以除去剩餘的液體。然而，鹽會對蛋白質的純度造成問題。

"鹽溶"是指在低鹽濃度溶液中，蛋白質的溶解度隨著鹽的新增而增加的現象。由於鹽的溶解度高於蛋白質，它更有可能溶解並佔據溶液中的空間；因此，蛋白質聚集並沉澱。相比之下，"鹽析"需要高鹽濃度才能使蛋白質沉澱。有兩種"鹽析"方法。在一種方法中，蛋白質暴露於高濃度的鹽溶液中，在另一種方法中，蛋白質暴露於一系列低濃度的溶液中。

蛋白質包含各種氨基酸序列和組成。因此，它們對水的溶解度因其表面的疏水或親水特性的程度而異。表面具有更大疏水特性的蛋白質會很容易沉澱。離子的新增會產生電子遮蔽效應，使水顆粒和蛋白質之間的一些活性失效，降低溶解度，因為蛋白質彼此結合並開始聚集。一般來說，較大的蛋白質比重量較小的較小的蛋白質需要更少的離子輸入。

在使用低濃度鹽溶液的過程中，蛋白質在過程早期沉澱。為了從溶液中提取蛋白質，將一系列濃度遞減的冷硫酸銨溶液用於沉澱物。為了回收提取的蛋白質，然後透過將冷溶液加熱到室溫使其再結晶。這個過程有很多優點，因為根據提取的蛋白質的不同，效率率可以達到30-90%，而且很少失敗。

硫酸銨是用於選擇性沉澱蛋白質的常見物質，因為它在水中非常可溶，允許約4M的高濃度。在這種狀態下，蛋白質的有害效應，如不可逆的變性，是不存在的，並且NH_4⁺ 和 SO_4^2- 都是有利的，非變性的，霍夫邁斯特序列的末端。硫酸銨可以從混合物中定量沉澱一種蛋白質。這種方法對於從細胞提取物中純化可溶性蛋白質非常有用。⁴

雖然鹽析被證明是一種有效的蛋白質分離方法，但它要求在最初計算或知道蛋白質的溶解度。蛋白質具有不同的氨基酸鏈和溶解度。在試圖改變鹽濃度以使蛋白質變得不溶時，不同的離子可以增加或降低蛋白質的溶解度。因此，必須謹慎選擇正確的離子來改變鹽濃度。蛋白質在其等電點 pI 附近或其淨電荷最小時通常溶解度最低。鹽析沉澱導致分級分離。在一種鹽濃度下收集一定量的沉澱蛋白質，而在另一種濃度下收集另一部分。這是因為蛋白質的某些部分可能比另一個區域更容易溶解。

具有不同 pI 值的蛋白質可以透過鹽析技術在不同的鹽濃度下透過動態 pH 值進行分離。由於蛋白質在其等電點 (pI) 附近溶解度最低，因此可以透過增加鹽濃度使其從溶液中沉澱出來。這是可能的，因為包圍蛋白質結構的水化層被溶劑中增加的離子濃度所取代。因此，透過用其他離子取代水化層，溶解蛋白質的水網路變得不穩定，並允許蛋白質在高鹽濃度下由於疏水基團聚集在一起而聚集。最終，蛋白質透過聚集（或“析出”）而沉澱。這種技術可用於分離最初具有相似沉澱點的蛋白質。透過改變溶液的 pH 值，可以增加或降低一種蛋白質的溶解度，而不影響目標蛋白質。此外，溶液可以透過透析來去除溶液中的鹽離子，從而進一步純化。

霍夫邁斯特序列

弗朗茨·霍夫邁斯特於 1888 年確定了不同離子的有效性。陰離子和陽離子系列中的第一個離子是使蛋白質最有效地沉澱出來的（被稱為“促溶劑”：與水相互作用良好的離子，形成氫鍵並脫水蛋白質），而末尾的離子是最低效的（被稱為“致溶劑”：透過破壞水分子之間的氫鍵來釋放水，增加蛋白質溶解度的離子）。^

陽離子: N(CH₃)₃⁺ > NH₄⁺ > K⁺ > Li⁺ > Mg²⁺ > Ca²⁺ > Al³⁺ > 胍

陰離子: SO₄^2- > HPO₄^2- > CH₃COO^- > 檸檬酸根 > 酒石酸根 > F^- > Cl^- > Br^- > I^- > NO₃^- > ClO₄^- > SCN^-

起始分子透過降低非極性分子的溶解度來增強疏水相互作用，從而使系統鹽析。然而，後面的分子由於破壞氫鍵的強離子相互作用而開始使蛋白質結構變性。雖然後面的分子可以透過硫酸銨等溶液進行鹽析，但某些分子也會經歷鹽溶，其中蛋白質的溶解度透過列表中的後面分子而增加。

透析

透析是一種蛋白質純化過程，它使用半透膜將蛋白質與其他小分子（如鹽）分離。這種膜包含微孔，小分子會從這些孔中逸出。因此，尺寸明顯大於孔徑的蛋白質分子被保留在透析袋內。小分子和鹽會透過膜擴散到袋外的透析液中。這種技術有助於去除鹽離子和其他小分子，但不能用於區分蛋白質。為了增強袋中蛋白質與其他雜質（如鹽）的分離，我們還可以利用平衡常數。在水性環境中，鹽會流過細胞膜，直到其在透析袋外的濃度等於袋內的濃度。此時，由於達到平衡，沒有淨鹽流過膜。但是，如果我們加入新的緩衝液溶液，那麼剩餘的鹽量將流出透析袋，直到緩衝液中的鹽濃度等於透析袋中的濃度。如果我們不斷更換緩衝液，這將提高透析袋中蛋白質的純度，因為每次我們更換緩衝液時，鹽都必須流出以達到其平衡常數。這一原理也可以應用於能夠透過膜逸出的其他雜質。

人體透析

在腎臟功能受損的患者中，透析通常用作去除血液中不需要的溶質的程式。例如，透析液中的鈣、鉀和尿素濃度保持在低濃度，使血液中的目標溶質能夠穿過半透膜擴散。然而，這需要不斷清洗透析液，以防止濃度平衡，這最終會導致血液中不需要的溶質濃度升高。在另一種情況下，溶質也可以被引入血液。例如，透析液中碳酸氫根離子的濃度很高，會擴散穿過膜。這樣做是為了防止代謝性酸中毒。

參考文獻

1. Berg, Jeremy M. 2007. Biochemistry. 第六版。紐約：W.H. Freeman。68-69, 78。

2. Voet, Voet, Pratt (2004). - 生物化學基礎

3. [[1]] 腎臟疾病圖譜，第 5 卷，透析原理：擴散、對流和透析機

4 ^[2] “第9章：蛋白質表達、純化和表徵”，《蛋白質：結構與功能》，Whitford 著，2005 年，John Wiley & Sons, Ltd

[2]