結構生物化學/蛋白質/純化/PFK-1 純化的微型化
我們正在從常規純化轉向微型純化，微型純化的體積是標準純化的百分之一，科學家們轉向微型純化的原因有很多。一個主要原因是生物化學家最終希望研究癌細胞。然而，他們預計提供的癌細胞將很小。因此，修改現有純化方法（常規純化）以實現微型純化（體積為百分之一）至關重要。
另一個原因是生物化學家將找到適合蛋白質體積的 DEAE Sephacel 顆粒容量，這意味著他們將用蛋白質飽和顆粒以找到最大容量。
背景資訊
蛋白質的標準純化被認為是生物化學技術中比較老式的技術，其中蛋白質根據其大小、電荷、溶解度、官能團等特性進行分離。在常規純化中，生物化學家通常從蛋白質源開始，並使用不同的分離組合技術，根據蛋白質的特性，例如離心和電泳，對蛋白質進行區分。微型純化與標準純化類似，但生物化學家修改了標準純化的規模。例如，在 DEAE 中，生物化學家可以使用 0.1 毫升的 DEAE-Sephacel 離子交換柱，而不是使用 50-60 毫升的柱子。一般來說，微型純化中採用的大多數技術的規模都進行了微型化。
方法和材料
研究人員在多種蛋白質中使用了微型純化技術，但我們將重點關注磷酸果糖激酶-1（PFK-1）的微型純化，PFK-1 是一種調節糖酵解過程的蛋白質。第一步通常是從來源獲取蛋白質，在本例中，來源是兔肌肉組織。然後，將肌肉組織混合並勻漿。但是，為了防止蛋白質分解，生物化學家通常使用充當蛋白酶抑制劑的化學物質，以保護蛋白質在勻漿過程中不被分解。然後將勻漿液進行平衡。
離心步驟緊隨勻漿步驟。在這一步，生物化學家通常根據密度分離上清液和沉澱物。PFK-1 是一種可溶性蛋白，因此我們預計它存在於上清液中。因此，我們可以直接丟棄上清液。此時，除了我們的蛋白質外，上清液中還有很多其他物質。
就像標準純化一樣，下一步將被稱為加熱步驟。當固體物質重新懸浮時，會進行熱變性。這一步的目的是變性溶液中所有除目標蛋白質以外的其他蛋白質。這可以透過使用包含底物 MgSO4 和 ATP 的溶液來完成，這些溶液可以穩定 rPFK-1，使其免於變性。然後，我們將上清液和沉澱物分離，我們預計我們的蛋白質存在於上清液中。
親和色譜技術用於根據蛋白質的電荷分離蛋白質。在加熱步驟之後，按照標準純化程式設定 1 毫升微型純化柱，使用 1/10 體積的 DEAE（離子交換）顆粒來分離酶。由於我們的蛋白質帶正電荷，而顆粒帶負電荷，因此我們的蛋白質會粘附在顆粒上。之後，新增不同濃度的小部分弱鹼。最後，我們將蛋白質與多個組分一起獲得。
最後，如果由於任何原因，純化不能在一天內完成，則需要進行額外的鹽析步驟來沉澱酶。由顆粒組成的 G-25 Sephadex 脫鹽柱透過大小分離酶和 NH4SO4。理想情況下，收集的前幾個組分預計將含有最大量的 PF Works Cited Russell, P.J. "Inhibition of rabbit muscle isozymes by vitamin C." the Harwood Academic Publishers imprin 15 (2000): 283-296.
K-1 活性，其中 NH4SO4 的含量最少。為了檢查蛋白質的純度，生物化學家使用 SDS-PAGE。在此步驟中，我們能夠識別我們的酶的純度及其分子量（以道爾頓為單位）。參考（Russell）Works Cited Russell, P.J. "Inhibition of rabbit muscle isozymes by vitamin C." the Harwood Academic Publishers imprin 15 (2000): 283-296.
, A. Williams，以及 T.A. Austin，（2000）J. Enzyme Inhibition，第 15 卷，283-296 頁。
P.J. Russell, A. Williams and D. Gapuz (1997) Biochem. Biophys. Res. Commun., 233, 386-388.