蛋白質組學/蛋白質 - 蛋白質相互作用/交聯
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交聯是兩個聚合物鏈之間形成的離子鍵或共價鍵。在生物科學的背景下，交聯通常是指連線兩個分子單元以研究其相互作用的分子反應。
在研究蛋白質-蛋白質相互作用的過程中，交聯技術已被證明在獲取有關蛋白質結構和功能的資訊方面非常重要。交聯也有助於闡明有關受體、訊號級聯和多蛋白複合物中蛋白質相互作用的關鍵資訊[1][2]。從交聯實驗中獲得的資訊非常強大，因為它提供了更高解析度的結構資料；可以將蛋白質-蛋白質相互作用對映到特定的氨基酸或結構域。交聯最重要的優勢在於它允許捕獲非共價蛋白質-蛋白質相互作用，這些相互作用是瞬時的或依賴於特定的生理條件，並將其捕獲在長期共價複合物中，即使在進一步處理（包括純化、富集和分析）過程中也能保留這些資訊[3]。
雙功能交聯試劑包含兩個反應性基團，因此可以建立一種方法來共價連線兩個目標基團。這些目標基團可以在同一個蛋白質上，也可以在不同的蛋白質上。這些試劑的常用目標是親核側鏈，如酪氨酸或半胱氨酸。
在同雙功能交聯試劑中，兩個反應性基團相同。大多數同雙功能交聯試劑會產生分子內交聯。
在異雙功能交聯試劑中，反應性基團不同。這允許分子間交聯。擁有不同的反應性基團使交聯劑能夠在不同分子上的特定官能團之間進行偶聯，並有助於最小化自身偶聯。
| 亞胺酯 | 亞胺酯交聯劑與伯胺反應生成醯胺鍵。所得到的醯胺被質子化，因此在生理 pH 下帶正電荷。亞胺酯同雙功能交聯劑可以穿過細胞膜，這使得它們在交聯膜內的蛋白質以及進行分子內交聯以研究蛋白質亞基結構方面具有優勢。 |  |
| NHS 酯 | NHS 酯與蛋白質的 N 末端存在的 α-胺基團和賴氨酸殘基上的 ε-胺基團反應形成醯胺鍵。在反應過程中形成共價醯胺鍵，釋放 N-羥基琥珀醯亞胺。NHS 酯交聯反應最常在磷酸鹽、碳酸氫鹽/碳酸鹽或硼酸鹽緩衝液中進行。與分子表面伯胺反應的 NHS 酯交聯劑會導致蛋白質構象發生改變，從而可能導致生物活性喪失。 |  |
| 馬來醯亞胺 | 當反應 pH 值在 6.5 到 7.5 之間時，馬來醯亞胺基團特異性地與巰基反應。形成的硫醚鍵是穩定的，並且不可逆。 | |
| 滷乙醯基 | 最常用的 α-滷乙醯交聯劑包含碘乙醯基，它在生理 pH 下與巰基反應。碘乙醯基與巰基的反應透過用硫醇取代碘來進行，生成穩定的硫醚鍵。 |  |
氧化交聯是由 Brown 等人引入的 [4]，它具有高度特異性。該過程由 Ni(II)-肽試劑 [N(II)-NH2-Gly-Gly-His-COOH] 和過酸的存在（如過氧鄰苯二甲酸鎂或oxone）介導 [5]。該機制的引發涉及過酸將 Ni(II) 氧化為 Ni(III)，從而產生高價氧物種。反過來，該物種隨後可以從芳香族氨基酸側鏈（如酪氨酸殘基）中剝奪電子。這個自由基陽離子隨後可以透過親電攻擊共價偶聯到附近的酪氨酸或半胱氨酸。最後，氫原子被未知物種抽象。最終產物是交聯的蛋白質複合物。要了解首次描述的完整機制，請參閱 Brown 等人[4]。
這種交聯方法的優勢在於，透過親和交聯策略，可以將 Ni(II)-肽選擇性地遞送至蛋白質，並在新增過酸時以所需的時間進行啟用。反過來，這種反應可能高度侷限，並且避免對無關蛋白質進行修飾，從而使資料解釋不那麼複雜。
交聯是研究蛋白質-蛋白質反應的有用工具，但大多數交聯方法的性質阻礙了它們在活細胞中的應用。最近，使用光敏氨基酸類似物在相互作用的蛋白質之間建立交聯，使科學家能夠在體內研究蛋白質複合物。含有光敏重氮環的亮氨酸和蛋氨酸類似物都被餵給生長的細胞。這些類似物被整合到蛋白質中，並在暴露於紫外線下時在相互作用的蛋白質之間建立交聯[6]。
光敏劑（如天然存在的核黃素）在暴露於光線下會發生光激發，將能量轉移到反應中。光激發的分子通常也具有很高的反應活性，通常會容易地與附近的化合物結合。該特性已被用於治療角膜圓錐症（一種角膜退行性疾病）的新型臨床療法。將核黃素溶液新增到眼睛中，並用紫外線啟用。反應性的核黃素在角膜上建立新的交聯鍵，恢復其部分機械強度[7]。
用於分析蛋白質-蛋白質相互作用的氨基酸類似物利用了光激發分子的反應活性。這些類似物與天然氨基酸相同，除了一個光敏重氮環。當暴露於紫外線下時，氮會被釋放，並形成一個反應性卡賓。活化的卡賓的半衰期非常短，因此反應必須與非常接近的基團發生。在蛋白質複合物中，卡賓將與附近的基團反應形成穩定的交聯鍵，將複合物“凍結”在其當前位置，使科學家能夠分析複合物內的蛋白質-蛋白質相互作用。
細胞在含有這些類似物的培養基中生長，細胞在合成過程中將它們整合到蛋白質中，這些蛋白質通常存在於相應的天然氨基酸的位置。產生了三種氨基酸類似物。光亮氨酸和光蛋氨酸大量生產，而光異亮氨酸的產量幾乎少 20 倍。
這些氨基酸類似物的令人興奮之處在於它們沒有毒性。研究表明，光氨基酸可以很好地整合到細胞中，在缺乏天然亮氨酸和蛋氨酸但富含光類似物的培養基中培養細胞，只會略微減緩生長，但細胞活力保持不變。此外，細胞的光活化不會影響活力。這使得這些氨基酸類似物可以在生長中的細胞中用於研究體內蛋白質-蛋白質相互作用，對細胞的影響最小[8]。
光激發重氮丙烷已整合到糖中以分析膜反應。具有重氮丙烷的單糖被整合到細胞表面，用紫外光激發，然後作為膜內糖蛋白複合物的組成部分進行分析。這些光糖在代謝上整合到細胞的糖蛋白中，可以捕獲糖蛋白之間的相互作用。由於重氮丙烷體積小，糖蛋白的功能相對不受影響[9]。
- ↑ Lynch 和 DE Koshland Jr. 大腸桿菌天冬氨酸感覺受體跨膜區的二硫鍵交聯研究。美國國家科學院院刊，第 88 卷，10402-10406。
- ↑ A. Fancy，Karsten Melcher，Stephen Albert Johnston 和 Thomas Kodadek。化學與生物學。1996 年 7 月，3:551-559。用於研究多蛋白複合物的新化學：六組氨酸標籤作為蛋白質交聯試劑的受體。
- ↑ A. Trakselis，Stephen C. Alley 和 Faoud T. Ishmael。透過交聯、裂解和蛋白質組學的結合鑑定和繪製蛋白質-蛋白質相互作用。生物偶聯化學。第 16 卷，第 4 期，第 741-750 頁。
- ↑ a b C. Brown，Sang-Hwa Yang 和 Thomas Kodadek。由鎳肽複合物介導的蛋白質高度特異性氧化交聯。生物化學 1995，34，4733-4739。
- ↑ A. Fancy。使用化學交聯或標記轉移技術闡明蛋白質-蛋白質相互作用。化學生物學最新觀點。第 4 卷，第 1 期，2000 年 2 月 1 日，第 28-33 頁。
- ↑ (2008 年 3 月 20 日)。在維基百科，自由的百科全書中。2008 年 3 月 30 日 14:59 檢索。
- ↑ (2008 年 3 月 19 日)。在維基百科，自由的百科全書中。2008 年 3 月 30 日 15:20 檢索。
- ↑ M.，Radzikowska，A. 和 Thiele，C. (2005) 光亮氨酸和光蛋氨酸允許在活細胞中鑑定蛋白質-蛋白質相互作用。自然方法。2，261 – 268
- ↑ Tanaka 和 Jennifer J. Kohler。用於捕獲糖蛋白相互作用的光活化交聯糖。美國化學會志；2008；130(11) pp 3278 – 3279
作者：Anthony Corbett，Joshua Horn