蛋白質組學/蛋白質樣品製備/電泳樣品製備
聚丙烯醯胺凝膠電泳 (PAGE)，在 第 4.2 章 中詳細描述，是一個透過分子量分離分子（通常是蛋白質）的過程。假設蛋白質在凝膠基質中的遷移速度與其質量直接相關，即蛋白質的總物質，那麼確保蛋白質的形狀不影響其速度至關重要。因此，已經改進了一些樣品製備技術，為樣品中的所有蛋白質賦予相似的形狀。此外，還改進了協議以最大限度地提高與質量相關的特性的一致性。本節旨在說明在為凝膠電泳製備樣品過程中涉及的多種技術的用途和程式。
十二烷基硫酸鈉 (SDS) 是一種陰離子去汙劑，用於在凝膠電泳之前使蛋白質變性。如上所述，必須使樣品中的所有蛋白質變性，以便僅根據其在凝膠基質中的質量來分離它們。SDS 有效地分解了 α-螺旋和 β-摺疊（都主要由氫鍵組成）以及許多三級結構。但是，SDS 不會分解參與許多三級結構的任何二硫鍵；通常需要用 DTT 處理，如以下所述，來分解二硫鍵。
SDS 在二維電泳 (2DE) 中被發現特別有用。正如 第 4.2 章 中提到的，2DE 涉及一個初始的等電聚焦 (IEF) 階段，該階段導致所有蛋白質在其等電點 (pI) 上找到其等電點 (pI)，導致所有蛋白質的淨電荷為零。由於 PAGE 的性質，需要負電荷來誘導蛋白質透過凝膠基質的運動。幸運的是，用 SDS 處理蛋白質樣品不僅使樣品中的所有蛋白質變性，而且還結合所有蛋白質並將負電荷賦予結合的蛋白質。人們發現 SDS 以與該蛋白質質量成正比的方式結合蛋白質，這會導致與蛋白質質量直接相關的負電荷；進一步支援僅基於質量的分離。
二硫蘇糖醇 (DTT) 是一種還原劑，通常用於分解二硫鍵，這些二硫鍵有助於 SDS 無法影響的三級結構，從而進一步使蛋白質變性，以弱化蛋白質形狀在 PAGE 中的作用。DTT 透過兩個連續的硫醇-二硫鍵交換反應還原二硫鍵，導致 DTT 變成一個六元環結構。另一種二硫鍵還原劑 2-巰基乙醇 (ME) 通常代替 DTT 使用。此外，應該注意的是，雖然 DTT 和 ME 都可以有效地減少蛋白質中的二硫鍵，但它們有重新形成的趨勢。因此，蛋白質樣品通常用 2-碘乙醯胺處理，這是一種烷基化硫醇試劑，它與遊離硫醇共價結合並阻止二硫鍵重新形成。
- 二硫蘇糖醇 (DTT)
- 2-巰基乙醇 (ME)
為了從酵母中提取蛋白質，將收集的酵母細胞重新懸浮在含有 NaOH、2-巰基乙醇和 SDS 的緩衝液中，並立即加熱至 90oC。然後用 Tris-HCl 緩衝液中和樣品。然後新增甘油和溴酚藍，以便最終樣品包含在標準 SDS-PAGE 緩衝液中。熱量和緩衝液的結合實際上破壞了所有細胞壁，同時使需要提取的蛋白質可溶。
改變 SDS 的濃度、沸騰時間以及新增增溶試劑可以改變和最佳化酵母蛋白質的提取。發現向上述方案中新增脫氧膽酸鹽或尿素可以最佳化某些蛋白質的提取，但會降低其他蛋白質的最佳化。上述引數對於提取 S. cerevisiae 中表達的大多數蛋白質是最佳的，但並非所有蛋白質都是如此。迄今為止，還沒有一種通用的緩衝液或方案可以從酵母細胞中產生所有表達的蛋白質。
von der Haar T PLoS One 2(10):1-8 (2007)
主要關注點
本文的主要關注點是找到酵母蛋白質的最佳提取技術。von der Haar 小組已經找到了針對大多數酵母蛋白質的最佳技術，但並非所有表達的蛋白質都是如此。
摘要
任何蛋白質的發表文章中得出的丰度資料可能因研究組而異。這是因為他們使用的提取程式的效率不同。von der Haar 小組已經找到了一個可以提取酵母S. cerevisiae 中大多數蛋白質的蛋白質提取程式。他們發現的最佳原始方案要求使用 0.1N NaOH 作為重新懸浮緩衝液，孵育幾分鐘，然後在標準 SDS-PAGE 樣品緩衝液中沸騰。該程式的問題是，當酵母在 0.1N NaOH 中懸浮和孵育時，並非所有細胞壁都被破壞。許多酵母細胞仍然是完整的。這可能導致酵母細胞表達在研究環境下通常不表達的蛋白質，而是由於 NaOH 環境而表達。von der Haar 小組已經設計了一種新的方案來解決這個問題。
新的方案要求提取的酵母細胞重新懸浮在含有 NaOH、2-巰基乙醇和 SDS 的緩衝液中，並立即加熱至 90oC。然後用 Tris-HCl 緩衝液中和樣品，然後新增甘油和溴酚藍，以便最終樣品包含在標準 SDS-PAGE 緩衝液中。熱量和新緩衝液的結合實際上破壞了所有細胞壁，同時使需要提取的蛋白質可溶。
von der Haar 小組還發現，改變 SDS 的濃度、沸騰時間以及新增增溶試劑可以改變蛋白質提取的最佳化。他們發現的最佳 SDS 濃度為 2%。最佳沸騰時間為 90oC 下 10 分鐘。這些引數對於提取S. cerevisiae 中表達的大多數蛋白質是最佳的，但並非所有蛋白質都是如此。新增 1% 脫氧膽酸鹽提高了 Sup45p 和 Rpl25p 的提取效率，但降低了 Sup35p 的提取效率。新增 8M 尿素提高了 Sup35p 的提取效率，但降低了所有其他蛋白質的提取效率。
Haal 小組確實找到了提取 S. cerevisiae 中表達的大多數蛋白質的最佳方案，但並非所有蛋白質都是如此。新增其他增溶劑可能對某些蛋白質是最佳的，但會顯著降低其他蛋白質的溶解度。很明顯，沒有一種通用的緩衝液或方案可以從酵母細胞中產生所有表達的蛋白質。
有關更詳細的步驟，請參見文章中的圖 1。
新術語
- 蛋白質組
- 在給定環境條件下，由生物體遺傳物質表達的一組蛋白質（http://www.answers.com/topic/proteome-2）
- 細胞密度
- 每單位體積的細胞數（http://www.oilgae.com/ref/glos/cell_density.html）
- YPD（酵母蛋白腖葡萄糖）
- 培養基含有蛋白腖、葡萄糖和其他用於生長S. cerevisiae 的物質（http://www.clontech.com/products/detail.asp?tabno=2&catalog_id=630409&page=all）
- 穩定期
- 也稱為 G0 期，是對營養缺乏或飢餓的反應。酵母細胞可以透過改變其結構和代謝來延長其壽命。（http://www.rose.brandeis.edu/PRLab/projects/yeast/yeast.html）
- 鹼性裂解
- 使用 NaOH 開啟細胞以分離 DNA 或蛋白質的方案（http://bitesizebio.com/2007/11/07/the-basics-how-alkaline-lysis-works/）
課程相關性
- 在蛋白質組學課程中，我們學習瞭如何透過質譜或凝膠電泳等實驗來定量分析特定條件下的蛋白質表達。但為了正確分析表達的蛋白質，必須有一種技術能夠提取大部分，如果不是全部的蛋白質。本文介紹了專門針對酵母提取蛋白質的最佳方法。
弗雷德·哈欽森癌症研究中心的Gottschling實驗室
http://labs.fhcrc.org/gottschling/Yeast%20Protocols/pprep.html (03/29/09)
主要關注點
該網站主要提供Gottschling實驗室的方案和其他資訊，該實驗室專注於癌症研究。
摘要
Gottschling實驗室對研究酵母，特別是S. cerevisiae，很感興趣，因為它們與癌症有關。當酵母細胞進入其生命週期的中晚期時，它們會經歷基因組不穩定。這種基因組不穩定也可能出現在人類身上，因為年齡增長和癌症。Gottschling小組認為，酵母所經歷的轉變與人類年齡增長和癌症發生率增加之間存在聯絡。
該網站提供了許多不同的方案，以及提取酵母蛋白質的方案。他們列出了三種不同的方法，用於製備用於直接凝膠電泳的酵母蛋白質。第一種方法使用SUMEB緩衝液和蛋白酶抑制劑來提取酵母蛋白質。該網站提供了製備SUMEB緩衝液所需的成分。第二種方案僅使用樣品緩衝液，該網站還提供了樣品緩衝液的配方。他們列出的第三種方案是使用玻璃珠和樣品緩衝液。
請參閱網站連結，以獲取有關快速蛋白質製備步驟的更詳細說明。
課程相關性
- 在蛋白質組學課程中，我們學習瞭如何透過質譜或凝膠電泳等實驗來定量分析特定條件下的蛋白質表達。但為了正確分析表達的蛋白質，必須有一種技術能夠提取大部分，如果不是全部的蛋白質。該網站提供了多種不同的方案，用於提取酵母蛋白質作為凝膠電泳的樣品。