蛋白質組學/蛋白質分離 - 色譜/親和

章節作者：Laura Grell 和 Alexander Butarbutar
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章節修改者：Kai Burnett 和 Dalia Ghoneim
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親和色譜

圖 1. 親和色譜柱

親和色譜是一種生物化學方法，旨在從混合樣品中分離蛋白質。它是最常用的技術之一，因為它在分離蛋白質方面非常選擇性和有效。該技術依賴於分子與固定在基質上的配體之間的獨特相互作用。親和色譜已應用於各種應用中，幾種型別的基質可隨時獲得，並可從各種供應商處購買。這些基質包括以下相互作用：

分子	配體
抗原	抗體
酶	底物
受體	配體
核酸結合蛋白	核酸
多糖、糖蛋白	凝集素

親和色譜已成功用於許多蛋白質標籤，最常見的應用之一是使用多組氨酸標籤。從基因產物中提取蛋白質可能是一項艱鉅的任務；一種常用的策略是在基因末端附近設計一個多組氨酸標籤。通常，組氨酸標籤相對較短，不會干擾蛋白質構象。在親和色譜中，多組氨酸標籤將結合到柱中的鎳樹脂。

開發有效的親和色譜方法涉及

1. 尋找足夠特異性的配體
2. 尋找目標蛋白與配體之間結合以及釋放蛋白的合適條件。

親和色譜的步驟

親和色譜過程可以分為 3 個主要步驟

1. 平衡
2. 樣品應用
3. 洗脫

平衡

親和色譜的第一步是透過將兩個識別成分之一固定在不溶性疏水性聚合物（如瓊脂糖）上，來製備固定相。

樣品應用

然後將含有另一個識別成分的粗提物應用於該固定相。只有那些被固定相吸引的成分會結合到柱上，其餘的成分會直接透過柱子洗滌。該步驟的成功高度依賴於目標分子足夠結合到配體的能力。平衡解離常數 (K_D) 是一個量化目標蛋白與其配體之間鍵合強度的值。K_D 值越低，鍵合越強。K_D 值在 10^-4 到 10^-6 之間對於目標分子結合到固定相是理想的。

如果 K_D 值過高，目標蛋白會洩漏。如果 K_D 值過低，目標蛋白會結合得太牢固。這可能會導致目標蛋白“不可逆”地吸附到固定相上。雖然在這種情況下，吸附並非真正不可逆，但所需的洗脫條件可能非常苛刻，並可能破壞蛋白質的功能。

在洗滌步驟中，通常包括高濃度鹽以克服較弱的識別相互作用，除那些緊密結合到固定相的蛋白質外，所有蛋白質都被洗脫。

洗脫

圖 2. 洗脫結合蛋白的一種方法是引入遊離配體，它會結合到目標分子上

圖 3. 透過引入另一種會取代目標蛋白並結合到配體的蛋白，可以洗脫結合蛋白

洗滌後進行洗脫步驟，在洗脫步驟中，使用固定化配體的可溶性形式來將結合的蛋白質從固定相上置換下來。

由於只有特定的目標樣品可以結合到固定相，因此不需要精細調節的洗脫梯度。在親和色譜中，可以簡單地立即從結合條件切換到釋放條件。

從固定相上洗脫目標分子有兩種可能的方法

1. 將 K_D 值從低變為高。洗脫的理想 K_D 值通常在 10^-1 到 10^-2 之間。可以透過改變條件（如鹽濃度、pH 值、溫度等）來改變 K_D 值。
2. 新增一個競爭者，它會將目標蛋白從配體上置換下來。這可能涉及新增遊離配體，它會結合到目標蛋白上並與蛋白一起洗脫，或者可以是一個結合到配體上並代替目標蛋白的競爭者（圖 2 和 3）。

目標分子

親和色譜中可以使用三組目標分子

1. 基於生物活性的特異性結合：這些包括受體結合位點、抗體結合位點和酶活性位點。這些與它們天然存在的配體或這些配體的類似物一起使用。如果配體類似物具有廣泛的特異性，則可以使用這些類似物分離分子組。
2. 天然存在的輔基：多糖就是這類物質的一個例子。這通常只在進行組分離時有用。
3. 經過工程改造的包含親和標籤的分子：常見的標籤示例包括 GST（谷胱甘肽-S-轉移酶）或具有可訪問的組氨酸殘基的蛋白質。這些親和標籤幾乎總是被設計到重組蛋白中，目的是為了分離。

配體

圖 4. 在製備固定相配體時，通常需要包含一個間隔臂，以避免可能發生的結合干擾

當使用單特異性配體時，很難找到針對每個案例的市售基質。公司通常銷售“活化凝膠”，這些凝膠具有可與配體偶聯的活性殘基。在組特異性色譜實驗中使用的配體通常可以在市面上買到，因為它們更廣泛適用。

較小的配體可能會導致一些問題。可能出現的一個問題是空間位阻。可能發生的另一個問題是配體的通路被阻斷，如圖 4 所示。間隔臂可以解決這個問題。

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資源

1. Davidson.edu 親和色譜方法
2. GE Healthcare 親和色譜動畫 || 親和與產品介紹
3. Craig, P. 親和色譜
4. EYLaboratories, Inc - 各種配體清單
5. 親和影像
6. Bio-Rad 親和色譜與產品

參考文獻

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