蛋白質組學/蛋白質分離 - 色譜法/分子排阻
章節作者：Laura Grell 和 Alexander Butarbutar
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章節修改者：Kai Burnett 和 Dalia Ghoneim
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分子排阻 /凝膠過濾 /凝膠滲透 /尺寸排阻 是最簡單的分離分子機制之一。該方法根據蛋白質的大小分離蛋白質。固定相填充了具有各種孔徑的多孔珠子。當將蛋白質混合物引入柱中時，從小到大、中到大各種大小的蛋白質將被過濾透過柱子。
- 小蛋白質可以適合任何孔徑並進入許多孔徑，然後才能到達柱子末端。因此，小蛋白質的運動受到極大阻礙，導致它們最後從 SEC 中洗脫出來。
- 中等大小的蛋白質可能適合一些孔徑，但不適合所有孔徑。這些蛋白質通常將在小蛋白質和大蛋白質之間洗脫出來。
- 大蛋白質無法進入珠子。它們在柱中的運動不受珠子的阻礙，這使得它們成為第一個從柱子中洗脫的蛋白質。
在實踐中，凝膠過濾可用於在蛋白質純化過程中的任何階段根據分子量分離蛋白質。它也可以用於緩衝液交換 -溶解在 pH 4.8 醋酸鈉緩衝液中的蛋白質可以被應用於已用 pH 8.0 磷酸三鈉緩衝液平衡的凝膠過濾柱。使用 pH 8.0 磷酸三鈉緩衝液作為流動相，蛋白質在穿過柱子時進入磷酸三鈉流動相，而比蛋白質小得多的醋酸鈉緩衝液分子完全包含在多孔珠子中，並且比蛋白質移動得慢得多。
實現高解析度蛋白質分離主要取決於兩個因素
- 足夠的 選擇性：創造條件，在樣品區之間產生足夠的空間
- 足夠的效率：抵消“區域擴散效應”
解析度可以用以下公式表示：
Vr1 和 Vr2：兩個相鄰峰的洗脫體積。因此，Vr2-Vr1 代表兩個峰之間的距離。
W1 和 W2：峰的寬度
解析度公式的分子代表選擇性或色譜圖中兩條不同曲線之間的距離。當距離太短時，兩條相鄰的曲線可能會開始合併，導致兩種蛋白質的分離不充分。選擇性由兩個因素控制：實際介質的選擇性和柱子的長度。
不同的流動相介質具有不同的選擇性曲線。有些介質提供高選擇性，而另一些介質提供低選擇性。選擇哪種介質通常反映了被分離蛋白質的型別和大小。
柱子的長度也對選擇性有影響。分子排阻不涉及任何梯度；因此，分子將以相當恆定的速率沿著柱子移動。如果兩個分子以不同的速率移動，則增加移動距離將隨後增加兩個分子之間的距離。增加柱子的長度是提高解析度的一種方法。然而，需要注意的是，隨著柱子長度的增加，樣品區會變寬。這種區域擴散效應會抵消一些獲得的解析度。
提高效率包括抵消區域擴散效應。理想情況下，特定蛋白質的所有樣品應該同時到達柱子末端；但是，一些因素會影響發生的區域擴散程度。其中兩個最重要的因素是：珠子的均勻性和珠子的尺寸以及流速。
在柱子中，珠子必須保持均勻性。不規則性會導致樣品的不同部分以不同的速度沿著柱子移動。樣品到達柱子末端的總時間範圍會變大，這不是理想的。
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