蛋白質組學/蛋白質分離 - 色譜/離子交換
章節作者：Laura Grell 和 Alexander Butarbutar
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章節修改者：Kai Burnett 和 Dalia Ghoneim
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離子交換可能是最常用的用於分離和純化蛋白質、多肽、核酸、多核苷酸和其他帶電生物分子的色譜技術（參考文獻1）。離子交換成功的原因為其廣泛的適用性、高分離能力、高容量以及方法的簡單性和可控性 (參考文獻2)
與其他形式的色譜一樣，離子交換色譜也利用固定相和流動相。此方法中的固定相帶有正電荷或負電荷。帶電固定相根據與其結合的帶電粒子的型別命名。
陰離子交換的固定相由合成聚合物（樹脂）組成，該聚合物包含許多帶正電荷的功能基團，通常是季銨離子。帶負電荷的物質會被樹脂吸引，並沿色譜柱緩慢移動。類似地，帶正電荷的物質會被陽離子交換樹脂的帶負電荷的功能基團吸引。磺酸鹽基團通常作為陽離子交換樹脂中的側鏈存在。固定相可作為顆粒狀材料或珠子使用，但現在預裝柱也易於獲得 : GE Healthcare，Sigma-Aldrich，Rohm and Haas，Sybron Chemicals，Edvotek 離子交換色譜試劑盒，Bio-Rad。可以透過改變緩衝液條件來釋放與固定相結合的顆粒。
蛋白質上的電荷會影響其在離子交換色譜中的行為。蛋白質在其氨基酸側鏈（包括其氨基和羧基末端）上包含許多可電離基團。這些包括賴氨酸、精氨酸和組氨酸側鏈上的鹼性基團以及穀氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸和酪氨酸側鏈上的酸性基團。溶液的pH值、側鏈的pK值和側鏈的環境會影響每個側鏈上的電荷。pH值、pK值和單個氨基酸電荷之間的關係可以透過亨德森-哈塞爾巴爾赫方程來描述，該方程在其他地方有詳細描述。
一般來說，隨著溶液pH值的升高，蛋白質上酸性和鹼性基團的去質子化會發生，使得羧基轉化為羧酸根陰離子（R-COOH到R-COO-），銨基轉化為氨基（R-NH3+到R-NH2）。在蛋白質中，等電點（pI）定義為蛋白質淨電荷為零時的pH值。當pH > pI時，蛋白質具有淨負電荷，當pH < pI時，蛋白質具有淨正電荷。pI因蛋白質而異。這就是離子交換對分離蛋白質有用的原因。如果使用含有不止一種蛋白質的緩衝液和陰離子交換樹脂，那麼帶負電荷最多的蛋白質將最受固定相吸引，因此最後洗脫，而帶正電荷最多的蛋白質將首先洗脫。
離子交換過程可以分為四個基本階段（參考文獻1）
- 平衡
- 樣品上樣
- 洗脫
- 再生
此階段涉及設定所需的起始條件，以便系統準備好進行離子交換過程。在此步驟中，施加具有所需條件的緩衝液，並且固定相中的所有帶電基團都與帶相反電荷的離子相關聯。當此過程完成時，即達到平衡。
在此步驟中，將樣品應用於固定相。只有帶與固定相相反電荷的蛋白質才會與其結合，而帶相同電荷或不帶電荷的蛋白質則不會結合。這些未結合的顆粒將在此階段洗脫。在上圖色譜圖中，蛋白質A從未與固定相結合並洗脫，形成第一個峰。
此步驟涉及改變緩衝液條件以洗脫已與固定相結合的顆粒。有幾種不同的方法可以做到這一點。一種選擇是改變緩衝液的pH值。如前所述，當蛋白質的pI與溶液的pH值相同時，蛋白質的淨電荷將為零。因此，當緩衝液的pH值達到蛋白質的pI時，蛋白質的淨電荷將為零。蛋白質將不再與固定相結合，並會被釋放和洗脫。洗脫結合蛋白質的另一種方法是增加鹽濃度。隨著緩衝液鹽濃度的增加，鹽離子取代結合的蛋白質。離子相互作用較弱的蛋白質將在較低的鹽濃度下釋放。帶電荷較強的蛋白質對固定相的親和力較高，並將更長時間地結合在色譜柱上。在上圖所示的色譜圖中，由於條件的變化，蛋白質B被釋放。紅線表示應用於系統的某些梯度。當蛋白質B釋放時，會產生第二個峰。
此步驟只需從固定相中去除所有結合的蛋白質，使其準備好進行另一個過程。
儘管陰離子交換劑所涉及的樹脂帶正電荷，但陰離子交換劑之所以得名，是因為其對陰離子的親和性。為了有效結合蛋白質，系統中緩衝液的pH值必須大於目標蛋白質的等電點，因為蛋白質在其等電點以上帶負電荷。
陰離子交換劑可以分為弱陰離子交換劑和強陰離子交換劑。弱交換劑上的帶電基團是一種弱鹼，由於去質子化作用，在高pH值下容易失去其電荷。另一方面，強陰離子交換劑由帶電基團組成，該基團是一種強鹼。強陰離子交換劑能夠在可變的pH範圍內維持其正電荷，而弱陰離子交換劑則隨著pH值的升高而傾向於失去其電荷。陰離子交換劑的例子包括強陰離子交換劑Q（季銨樹脂）和弱陰離子交換劑DEAE（二乙氨基乙烷）。
通常，色譜是在pH值為7到10的緩衝液中進行的，並從僅包含此緩衝液的溶液到包含此緩衝液和1M NaCl的溶液進行梯度洗脫 (Res1)。鹽（在溶液中）與固定相的結合位點競爭，從而使蛋白質從其結合狀態釋放出來。蛋白質分離是因為競爭所需的鹽量隨蛋白質的外部電荷而變化。陰離子交換色譜已成功用於粗漿的純化、蛋白質彼此分離、蛋白質濃縮以及從蛋白質製劑中去除帶負電荷的內毒素 (Res1)。
離子交換在實踐中。為了透過離子交換洗脫未知蛋白質，需要不同濃度鹽和適當緩衝液的梯度，以測試在哪個鹽濃度下洗脫我們所需的蛋白質。在陰離子交換的情況下，使用DEAE填充色譜柱。使用Bis-tris等緩衝液進行平衡、洗滌和洗脫。通常使用注射泵透過色譜柱泵送各種緩衝液。在進行離子交換之前，目標蛋白質首先在Bis-tris緩衝液中平衡。一些蛋白質可能在Bis-tris中沉澱，因此溶解度可能是離子交換過程中潛在的問題。色譜柱首先用不含鹽的緩衝液平衡。常用的鹽之一是氯化鈉。製備包含逐漸增加鹽濃度的緩衝液，例如50mM NaCl、100mM NaCl、150mM NaCl等。最後，使用1M NaCl緩衝液徹底清洗色譜柱。所有緩衝液都需要調節其pH值，因為蛋白質對pH值敏感。如圖所示，收集濃度逐漸增加的鹽的餾分。收集所有餾分後，取樣進行SDS-PAGE。透過凝膠，我們可以確定在哪個鹽濃度下洗脫了我們的蛋白質，以及分離效果如何。測試規模不需要大量的蛋白質混合物。在大規模蛋白質純化中，含鹽緩衝液可以從較高濃度開始作為有效的洗滌液。將從所有餾分中取樣以跟蹤我們的純化過程。
陽離子交換劑因其吸引陽離子或帶正電荷粒子的能力而得名。在這種情況下，色譜系統的樹脂帶負電荷，如果緩衝液pH值小於蛋白質的獨特等電點，則蛋白質將結合。
與陰離子交換劑一樣，陽離子交換劑也可以分為弱陽離子交換劑和強陽離子交換劑。弱陽離子交換劑由弱酸組成，隨著pH值的降低，其電荷逐漸降低，而強陽離子交換劑由強酸組成，能夠在較寬的pH範圍內維持其電荷。羧甲基通常用作弱陽離子交換劑，而磺丙基則廣泛用作強陽離子交換劑 (Res1)
選擇正確的樹脂和緩衝液至關重要，因為它決定了蛋白質與樹脂的結合特性。在陽離子交換中，目標蛋白質需要帶正電荷才能與帶負電荷的固定相結合。假設我們有以下蛋白質的混合物
| 蛋白質 | pI | pH 4.8 cm | pH 7.2 cm | pH 8 cm |
| 碳酸酐酶 | 7.0 | +16.5 | -0.4 | -2.7 |
| 羧肽酶B | 6.2 | +12.0 | -3.3 | -6.3 |
| 胰凝乳蛋白酶 | 8.0 | +9.0 | +2.7 | 0.0 |
| 溶菌酶 | 9.8 | +14.1 | +7.9 | +6.9 |
- 在pH 4.8 cm時，所有蛋白質都將結合到陽離子交換劑上，其中碳酸酐酶與固定相的結合最強。如果在此pH值下進行洗脫，則蛋白質的洗脫順序為胰凝乳蛋白酶、羧肽酶B、溶菌酶和碳酸酐酶。
- 在pH 7.2 cm時，碳酸酐酶和羧肽酶B將在洗滌過程中洗脫（在梯度開始之前），然後是胰凝乳蛋白酶，最後在鹽梯度過程中洗脫溶菌酶。
- 在pH 8 cm時，只有溶菌酶將結合到固定相上，其他三種蛋白質將在洗滌過程中洗脫。
還可以最佳化溶劑A和B中的鹽濃度，以便即使弱結合的蛋白質帶正電荷，也能夠在洗滌過程中從色譜柱上洗脫。例如，如果將pH 4.8 cm修改為在溶劑A中含有0.1 M NaCl，在溶劑B中含有0.2 M NaCl，您會發現結合最弱的蛋白質（胰凝乳蛋白酶）在洗滌過程中洗脫，而其他三種蛋白質在梯度過程中洗脫。
- GE Healthcare 離子交換動畫
- Craig. P., 羅切斯特理工學院 離子交換色譜
- 可以在此處找到模擬離子交換色譜的線上JAVA小程式：Ionex模擬（有關如何設定實驗和使用模擬執行實驗的說明可在連結中找到）
- 離子交換影像
- Bio-Rad 離子交換色譜和產品
- Sigma-Aldrich 離子交換樹脂和相關聚合物吸附劑
- 羅姆哈斯 離子交換樹脂產品
- 恰當的時間採取正確的步驟。生物/技術，4，954-958（1986），Bonnerjera，J.，Oh，S.，Hoare，M.，Dunhill，P。
- 安瑪西亞生物科學 離子交換色譜原理和方法*
- Vydac 生物分離中高效離子交換色譜的原理和應用 *
- Ellyn A. Daugherty 使用離子交換色譜分離蛋白質 *
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