結構生物化學/蛋白質/純化/離子交換色譜法
目的：利用離子電荷的性質，從混合物中分離特定的蛋白質。
離子交換色譜法 (IEC) 是一種 純化 方法，旨在根據電荷分離蛋白質，該電荷取決於流動相的組成（分離溶解的混合物）。調整“流動相”的pH值或離子濃度可以實現分離。例如，如果蛋白質在pH 7時具有淨正電荷，它將結合到具有負電荷珠的柱上。另一方面，帶負電荷的蛋白質不會。例如，如果質子在pH 7時具有淨正電荷，那麼它將結合到包含羧基的珠柱上，而帶負電荷的蛋白質則不會。一旦結合，蛋白質就會透過增加離子濃度來洗脫。蛋白質的運動取決於淨電荷密度；淨正電荷密度低的蛋白質將首先出現。蛋白質由於蛋白質表面電荷與交換器上帶電基團簇之間的靜電力而結合到離子交換器上。柱中填充有樹脂（通常是纖維素或瓊脂糖），樹脂上鍵合著帶電基團。這使得帶正電荷的 蛋白質（例如）能夠結合到柱上的帶負電荷珠上，而帶負電荷的蛋白質則能夠流過柱。因此，離子交換色譜法包括陽離子交換色譜法和陰離子交換色譜法。此外，蛋白質必須置換反離子並附著；換句話說，蛋白質上的淨電荷將與置換的反離子的符號相同，因此稱為“離子交換”。溶液中的蛋白質分子也被反離子中和；總反應必須是電中性的。任何想要純化的東西都稱為樣品，分離的部分稱為分析物。將樣品新增到柱頂，並使用緩衝溶液進行洗脫。
陰離子交換色譜法涉及使用帶正電荷的珠子。在酸的純化中，酸在其羧基上通常帶有負電荷，因此利用陰離子交換色譜法。陰離子交換色譜法主要透過離子交換樹脂上的胺基與天冬氨酸或穀氨酸側鏈的相互作用來收集生物分子，這些側鏈的pK值約為4.4。流動相在pH > 4.4下被緩衝，低於該pH值，酸側鏈開始質子化，保留率下降。
在pH 4.4以上，保留率基本上取決於蛋白質中存在的陰離子側鏈的數量。包括相同數量陰離子側鏈的蛋白質通常可以透過在7到10之間修改流動相pH值來分離，在該pH值範圍內，組氨酸不被質子化，賴氨酸開始去質子化。
在這個pH區域，蛋白質會發生微妙的變化，影響蛋白質與樹脂的相互作用，並允許對陰離子交換分離進行微調。不建議使用pH > 10的流動相，因為在較高pH值下可能會發生蛋白質剝奪，例如脫氨。
在陽離子交換色譜法中，將包含在特定 pH 下具有淨正電荷的特定蛋白質的樣品新增到柱中。在陰離子交換色譜法中，將包含在特定pH下具有淨負電荷的蛋白質的樣品新增到柱中。回想一下，淨電荷是在給定pH下每個氨基酸特定R基團的偏電荷之和。柱子含有由纖維素（或瓊脂糖）珠子組成的樹脂，該樹脂上共價鍵合著官能團。對於陽離子交換，使用羧酸鹽基團，對於陰離子交換，使用二乙氨基乙基基團。緩衝溶液，也稱為流動相，其pH值設定在蛋白質的pI或pKa與柱上珠子的pKa之間。然後，緩衝溶液使樣品透過柱子。沒有電荷或與珠子具有相同電荷的分子將透過，而具有相反電荷的分子將結合到珠柱上。就像磁鐵一樣，它會粘住並保持在那裡。為了洗脫結合的蛋白質，用鹽沖洗柱子，通常是過量的NaCl。在陽離子交換色譜法中，Na+離子將與結合的蛋白質競爭負官能團，在陰離子交換色譜法中，Cl-離子將競爭性地結合柱子。另一種沖洗系統的方法是使用低pH緩衝液。更酸性的條件將降低蛋白質的淨電荷（或使其更正）。由於蛋白質現在帶有正淨電荷，因此它不再覺得有必要與類似電荷的樹脂（因為類似電荷相互排斥）在一起，因此將以純形式從柱中出來。瞭解蛋白質樣品的等電點 (pI) 在離子交換色譜法中可能會有所幫助。回想一下，pI是在化合物淨電荷為零時的pH值。因此，如果我們有一個pI很高的化合物，例如10，那麼將pH值降至7會導致化合物變為正電荷。相反，如果溶液的pH值高於pI，則蛋白質整體變為負電荷，因此形成更多陰離子。因此，根據蛋白質的pI，可以針對特定的pH值使用不同的溶劑來純化蛋白質。這也意味著具有兩個顯著不同的pI的蛋白質在離子交換中最為成功。
如果樣品中含有與被分離蛋白質具有相似電荷的雜質，則需要使用pH梯度緩衝溶液。除非蛋白質具有完全相同的氨基酸，否則它們不太可能在完全相同的pH值下具有完全相同的電荷。升高（或降低）pH值，這實際上導致更多分子去質子化（或質子化），將導致分子略微改變電荷（負或正）。這將影響分子與樹脂之間的離子相互作用，導致一些分子從柱中洗脫。透過改變pH值，不同的分子將具有不同的電荷密度（或負電荷程度；-2,-1,-3等）。因此，在某個pH值下，蛋白質可能具有更高或更低的電荷密度，因此將以不同的方式結合到樹脂上，而電荷密度較低的蛋白質將首先洗脫。
舉另一個例子，假設我們正在分析一個空氣樣品，該樣品已收集在空氣過濾器上，並透過過濾器提取（將水新增到過濾器中，透過另一個過濾器進行純化，並將水提取為樣品）。然後，透過新增一定量的樣品和一定量的水來進一步製備樣品，以放入IC（離子色譜儀）中。首先將一系列標準溶液和水透過IC進行校準。標準溶液包含要檢測樣品中的特定陽離子或陰離子，具體取決於執行的是哪種離子色譜法。所有樣品都透過IC後，將為每個標準溶液和樣品溶液建立離子色譜圖（見影像）。在離子色譜圖中，可以看到分析物的分離情況。由於帶正電荷或負電荷的樹脂，每個分析物以不同的速度透過柱子。在離子色譜圖中，可以看到每個分析物透過所需的時間以及存在的量。每個分析物都將在每個樣品中以一致的時間透過柱子，因此可以確定每個峰是哪些分析物。
