結構生物化學/蛋白質/純化/離子交換色譜
目的：利用離子電荷的特性，從混合物中分離特定蛋白質。
離子交換色譜 (IEC) 是一種 純化 方法，旨在根據電荷分離蛋白質，這取決於流動相的組成（分離溶解的混合物）。調節“流動相”的 pH 值或離子濃度可以實現分離。例如，如果蛋白質在 pH 7 時具有淨正電荷，它將結合到帶負電荷的珠子柱上。另一方面，帶負電荷的蛋白質不會。例如，如果質子在 pH 為 7 時具有淨正電荷，那麼它將結合到包含羧基的珠子柱上，而帶負電荷的蛋白質則不會。一旦結合，透過增加離子濃度即可洗脫蛋白質。蛋白質的運動取決於淨電荷密度；淨正電荷密度低的蛋白質將首先出現。蛋白質由於蛋白質表面電荷和交換器上帶電基團簇之間的靜電力而結合到離子交換器上。色譜柱填充有帶有結合到其上的帶電基團的樹脂（通常是纖維素或瓊脂糖）。這使得帶正電荷的 蛋白質（例如）能夠結合到色譜柱上帶負電荷的珠子上，而帶負電荷的蛋白質則能夠流出色譜柱。因此，離子交換色譜包括陽離子交換色譜和陰離子交換色譜。此外，蛋白質必須置換抗衡離子並被附著；換句話說，蛋白質上的淨電荷將與置換的抗衡離子的符號相同——因此是“離子交換”。溶液中的蛋白質分子也被抗衡離子中和；總反應必須是電中性的。任何想要純化的東西都被稱為樣品，而分離的部分被稱為分析物。樣品加入色譜柱頂部，使用緩衝溶液洗脫。
陰離子交換色譜涉及使用帶正電荷的珠子。在酸的純化中，酸通常在其羧基上帶有負電荷，因此利用陰離子交換色譜。陰離子交換色譜主要透過離子交換樹脂上的胺基與天冬氨酸或穀氨酸側鏈（pK 約為 4.4）的相互作用來收集生物分子。流動相在 pH>4.4 時被緩衝，低於此 pH 值，酸側鏈開始質子化，保留率下降。
在 pH>4.4 時，保留率基本上取決於蛋白質中存在的陰離子側鏈的數量。包括相同數量的陰離子側鏈的蛋白質通常可以透過改變 7 到 10 之間的流動相 pH 值來分離，其中組氨酸沒有被質子化，賴氨酸開始被去質子化。
在這個 pH 區域中，蛋白質會發生微妙的變化，這些變化會影響蛋白質與樹脂的相互作用，從而可以對陰離子交換分離進行微調。流動相 pH>10 通常不建議，因為在較高 pH 值下可能會出現蛋白質降解，例如脫氨。
在陽離子交換色譜中，將包含在特定 pH 下具有淨正電荷的特定蛋白質的樣品加入到色譜柱中。在陰離子交換色譜中，將包含在特定 pH 下具有淨負電荷的蛋白質的樣品加入到色譜柱中。請記住，淨電荷是在給定 pH 值下每個氨基酸特定 R 基團的部分電荷的總和。色譜柱含有由纖維素（或瓊脂糖）珠子組成的樹脂，這些珠子上共價結合著功能基團。對於陽離子交換，使用羧酸鹽基團，而對於陰離子交換，使用二乙氨基乙基基團。緩衝溶液，也稱為流動相，其 pH 值設定在蛋白質的 pI 或 pKa 與色譜柱上珠子的 pKa 之間。然後，緩衝溶液將樣品透過色譜柱。不帶電荷或與珠子帶相同電荷的分子將透過，而帶相反電荷的分子將結合到珠子柱上。就像磁鐵一樣，它會粘在那裡。為了洗脫結合的蛋白質，用鹽（通常是過量的 NaCl）沖洗色譜柱。在陽離子交換色譜中，Na+ 離子將與結合的蛋白質競爭負功能基團，而在陰離子交換色譜中，Cl- 離子將競爭結合色譜柱。另一種沖洗系統的方法是使用低 pH 緩衝液。更酸性的條件會降低蛋白質的淨電荷（或使其更正）。由於蛋白質現在帶有正淨電荷，它不再被迫與類似電荷的樹脂（因為類似電荷相互排斥）一起存在，因此將從色譜柱中純淨地流出。瞭解蛋白質樣品的等電點 (pI) 在離子交換色譜中可能會有所幫助。請記住，pI 是化合物淨電荷為零的 pH 值。因此，如果我們有一個 pI 很高的化合物，例如 10，那麼將 pH 值降至 7 會導致化合物變為正電荷。相反，如果溶液的 pH 值高於 pI，則蛋白質總體上會變為負電荷，因此會形成更多的陰離子。因此，根據蛋白質的 pI，可以針對特定 pH 值的不同溶劑來純化蛋白質。這也意味著，具有兩個顯著不同 pI 的蛋白質在離子交換中最為成功。
如果樣品中存在與要分離的蛋白質具有類似電荷的雜質，則需要 pH 梯度緩衝溶液。除非蛋白質具有完全相同的氨基酸，否則它們不太可能在完全相同的 pH 值下具有完全相同的電荷。提高（或降低）pH 值，實際上會導致更多分子被去質子化（或質子化），這會導致分子略微改變負電荷（或正電荷）。這將影響分子與樹脂之間的離子相互作用，導致一些分子從色譜柱中洗脫。透過改變 pH 值，不同的分子將具有不同的電荷密度（或負電荷程度；-2、-1、-3 等）。因此，在某個 pH 值下，蛋白質可能具有較高或較低的電荷密度，因此將以不同的方式結合到樹脂上，而電荷密度較低的蛋白質將首先洗脫。
舉另一個例子，假設我們正在分析一個已經收集到空氣過濾器上並經過過濾器萃取的空氣樣本（在過濾器中新增水，透過另一個過濾器進行純化，然後提取水作為樣品）。然後，透過新增一定量的樣品和一定量的水，將樣品進一步製備以放入 IC（離子色譜儀）中。首先，一系列標準溶液和水透過 IC，以便校準儀器。標準溶液由某些陽離子或陰離子組成，具體取決於正在進行的離子色譜，這些離子將要檢測到的樣品中。一旦所有樣品都透過 IC，就會為每個標準溶液和樣品溶液建立離子色譜圖（見影像）。在離子色譜圖中，可以觀察到分析物的分離。每個分析物以不同的速度透過色譜柱，這是因為樹脂帶有正電荷或負電荷。在離子色譜圖中，可以觀察到每個分析物透過的時間以及存在的量。每個分析物將在每個樣品中始終如一地經過色譜柱，因此每個峰都可以確定為某些分析物。
