結構生物化學/交聯技術

交聯是研究 蛋白質相互作用的一種方法，在涉及蛋白質時常稱為生物偶聯。交聯涉及將蛋白質透過一個小的交聯劑共價連線到另一個 大分子（通常是另一個蛋白質）或固體載體。交聯劑或交聯劑是至少具有兩個反應性末端的分子，用於連線聚合物鏈。交聯劑通常對蛋白質中常見的官能團有反應性，例如羧基、胺和硫醇。

交聯劑型別

同雙功能交聯劑

同雙功能交聯劑是分子，在交聯劑的每一端具有相同的反應性基團。同雙功能交聯劑可以很好地瞭解溶液或細胞中存在的分子之間的所有相互作用，但也可能引起不希望的交聯。反應性末端是無偏的，可能會將蛋白質與相同蛋白質交聯，而此時可能需要不同蛋白質之間的相互作用。同雙功能交聯劑通常還會產生分子內交聯。

異雙功能交聯劑

異雙功能交聯劑是分子，在交聯劑的每一端具有不同的反應性基團。異雙功能交聯劑在形成的交聯中更具選擇性，因為可以選擇每個基團的反應性，以便特定蛋白質僅與一端結合。還可以建立一個兩步法來最大限度地減少不希望的交聯。首先，將交聯劑新增到含有一種特定蛋白質的溶液中，並使其反應。然後，將連線有交聯劑的蛋白質純化，並新增到含有一種第二種蛋白質的溶液中，該蛋白質將與交聯劑上的另一個反應性基團形成交聯。然後可以使用不同的技術來分析這種新結構，以檢視連線的蛋白質、連線的數量或其他所需資訊。

交聯劑反應基團

交聯劑中使用了許多不同的反應性基團，這些基團針對蛋白質上的不同官能團，包括羧基、胺、硫醇和羥基。通常根據交聯劑的反應性、長度和溶解度來選擇交聯劑。交聯劑也可以在新增到樣品後自發反應，或者在特定時間啟用，通常透過光反應基團。

雖然可以選擇交聯劑僅針對特定型別的官能團，但大多數蛋白質都包含幾個具有每種型別基團的殘基。如果有多個目標位點可用於結合，則交聯劑將失去特異性，並且將形成多個交聯產物。但是，只有當目標官能團位於蛋白質表面時，交聯劑才能結合。因此，蛋白質摺疊通常會阻擋許多可能的反應位點的通路，從而提高交聯的特異性。

N-羥基琥珀醯亞胺酯（NHS 酯）

NHS 酯與胺反應生成穩定的醯胺基團。因此，NHS 酯可用於連線到蛋白質的 N 端或賴氨酸殘基。反應通常在弱鹼性條件（pH 7.2-8.5）下進行。但是，所需的反應與 NHS 酯的水解競爭。水解速度隨著 pH 值的升高而增加，因此必須更嚴格地控制緩衝溶液的 pH 值。

亞胺酯

亞胺酯是與伯胺形成脒的反應性基團。與 NHS 酯一樣，亞胺酯可用於連線到蛋白質的 N 端或賴氨酸殘基。亞胺酯的反應性隨 pH 值的升高而增加，反應通常在 pH 8 到 10 之間進行。然而，亞胺酯在較高 pH 值下變得不穩定，因此不如 NHS 酯穩定。亞胺酯可用於連線膜蛋白，並用於探測脂質-蛋白質相互作用，因為它們能夠穿透細胞膜。

碳二亞胺

碳二亞胺不是傳統的交聯劑，因為交聯劑本身不會成為蛋白質-蛋白質複合物的一部分。碳二亞胺透過在一種蛋白質的羧酸基團和另一種蛋白質的胺基團之間形成醯胺鍵，直接將兩種蛋白質共價連線在一起。由於碳二亞胺交聯劑的機制，它們本質上是零長度（它們不會成為分子的一部分）和異雙功能交聯劑。EDC（1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺）是唯一眾所周知的碳二亞胺交聯劑。

馬來醯亞胺

馬來醯亞胺在生理 pH 值下與硫醇反應生成穩定的硫醚鍵，通常與半胱氨酸殘基連線。由於蛋白質中通常存在比胺基團少得多的遊離硫醇基團，因此馬來醯亞胺往往比針對胺的反應性基團更具特異性。此外，由於硫醇通常參與二硫鍵，因此連線到交聯劑通常不會干擾蛋白質的結構。

滷代乙醯

與馬來醯亞胺一樣，滷代乙醯在生理 pH 值下與硫醇基團反應生成硫醚鍵。最常見的滷代乙醯是碘代乙醯和溴代乙醯，它們透過硫醇的硫對鹵化物的親核取代反應進行反應。

吡啶基二硫化物

吡啶基二硫化物與硫醇反應形成二硫鍵。它們在很寬的 pH 範圍內都有活性，但 pH 4-5 為最佳。由於形成了二硫鍵，因此可以使用正常的二硫化物還原劑將該鍵裂解。

重氮甲烷

重氮基化合物是一種光敏基團的例子。雖然大多數其他反應性基團在新增到樣品後會自發反應，但光敏基團在暴露於紫外光之前會處於惰性狀態。蛋氨酸和亮氨酸的重氮基類似物通常被整合到蛋白質中，然後在樣品溶液或細胞中被光活化。活化後，重氮基將與光敏類似物附近幾埃範圍內的任何蛋白質發生反應。這使得蛋白質-蛋白質相互作用能夠在活細胞中被捕獲和研究。

儘管進行了結構修飾，由蛋氨酸和亮氨酸的重氮基類似物製成的蛋白質仍然是可行的，儘管它們的生長速度略有下降。這使得能夠建立無毒的光敏蛋白。因此，氨基酸類似物及其整合的蛋白質可用於研究體內蛋白質-蛋白質相互作用，而不會嚴重干擾細胞。

蛋白質交聯應用

交聯是一種很好的技術，可以瞭解更多關於蛋白質-蛋白質相互作用的資訊。通常情況下，蛋白質之間的相互作用太弱而無法正常觀察到，但透過交聯，可以使這些相互作用固化並易於檢測。這在確定細胞中的某些蛋白質是否相互作用，以及可能導致更多關於細胞如何運作的資訊方面可能有用。交聯的另一個用途是將蛋白質連線到固體基質上，以固定它們，以便更容易地分析它們。交聯也可以用於將標籤連線到蛋白質上，以幫助檢測其存在。

可以選擇具有不同反應端之間的長度的交聯劑，這可以幫助確定蛋白質結構中某些功能基團之間的距離。例如：如果將幾種具有相同反應端但具有不同長度的交聯劑分別新增到含有待分析蛋白質的溶液中，那麼根據哪個溶液發生了反應，就可以根據所新增的交聯劑確定目標功能基團之間的距離。

蛋白質-蛋白質相互作用

可以使用交聯劑來確定蛋白質之間的相互作用，實質上是在蛋白質相互作用時將它們凍結在一起。這種技術創造了一個穩定的蛋白質對，可以透過凝膠電泳或蛋白質印跡法進行純化或研究。最常見的是表徵體內蛋白質-蛋白質相互作用，其中可以在目標相互作用啟動後的不同時間進行交聯。由此產生的交聯可以指示細胞在對某些刺激的反應過程中發生的相互作用。

使用交聯劑研究蛋白質-蛋白質相互作用的另一種方法是使用可裂解的、標記的、光敏交聯劑來標記與“誘餌”蛋白相互作用的任何蛋白。該標籤可以是放射性同位素或質量變體。通常使用異雙功能交聯劑，一端連線到純化的誘餌蛋白，另一端是光敏基團。光敏端可以透過紫外輻射在不同的時間被活化，這將導致它立即與遇到的第一個基團發生反應 - 希望是一個與誘餌蛋白相互作用的蛋白質或輔因子。然後可以裂解交聯劑，將標籤轉移到另一個蛋白質或輔因子。

結構和亞基分析

交聯劑可用於定量某些氨基酸，以及確定亞基的數量和它們之間的距離。使用僅在長度上不同的多個交聯劑可以確定特定氨基酸功能基團之間的距離。這些資訊可以用來確定氨基酸在二級、三級和四級結構中的相對位置。結合巰基的同雙功能交聯劑也可以用來用不可裂解的連線取代蛋白質中的二硫鍵。

免疫毒素

交聯劑可以用來將毒素分子連線到針對腫瘤細胞的抗體上。抗體將與腫瘤細胞表面的抗原結合，交聯的複合物被細胞吸收。一旦進入細胞內部，毒素就會釋放並活化，殺死細胞。為了有效，交聯的抗體-毒素必須是穩定的，並且能夠在體內定位和靶向正確的細胞。

免疫毒素需要一個可裂解的交聯劑，以便毒素在進入細胞後被釋放。SPDP是用於免疫毒素最常見的交聯劑之一，它包含一個NHS酯和一個吡啶基二硫鍵。NHS酯首先連線到抗體，然後吡啶基二硫鍵連線到毒素。由於許多毒素沒有表面巰基，因此透過還原二硫鍵來產生遊離巰基。一些使用的毒素是蓖麻毒素和相思豆毒素。

蛋白質-蛋白質共軛

蛋白質-蛋白質共軛物在 ELISA 和蛋白質印跡等許多免疫檢測方法中使用。通常，酶連線到針對目標抗原的特定抗體。抗體將與抗原結合，連線的酶將催化可檢測的反應，表明抗原的存在。辣根過氧化物酶和鹼性磷酸酶是最常用的酶，因為它們產生的產物很容易透過光譜法檢測到。

小的肽抗原也可以與更大的蛋白質結合，以生產免疫原。免疫原通常透過將動物（通常是老鼠）注射抗原並收集動物響應產生的抗體來製備。小的肽通常不夠大，無法在動物體內產生抗原反應，因此與更大蛋白質的連線對於產生有效的抗原可能是必要的。

固相固定化

交聯劑可用於將蛋白質連線到固體支援物上，方法是選擇含有交聯劑一端特異性識別的功能基團的固體樹脂。將蛋白質連線到固體支援物上，可以進行親和純化和蛋白質分析。其他生物分子，如 DNA，也可以透過類似的方式連線到固體支援物上。儘管 DNA 交聯受到缺乏交聯劑通常靶向的功能基團的阻礙，但可以透過在特定鹼基上新增伯胺或硫醇來修飾 DNA，以增加交聯劑活性。