結構生物化學/核酸/DNA/複製過程/DNA聚合酶
DNA複製的完整過程包括20多種蛋白質的錯綜複雜的協調相互作用。1958年，阿瑟·科恩伯格及其同事從大腸桿菌中分離出DNA聚合酶。DNA聚合酶是第一個已知的酶，其功能是促進構成DNA骨架的連線單元的鍵形成。大腸桿菌擁有各種數量的DNA聚合酶，用羅馬數字表示，在DNA複製和修復中發揮重要作用。
DNA聚合酶是一種酶。這種酶從舊的DNA模板合成新的DNA鏈，並修復DNA以避免突變。DNA聚合酶催化形成磷酸二酯鍵，構成DNA分子的骨架。它在催化活性中使用鎂離子來平衡來自磷酸基團的電荷。
核苷酸只能新增到新鏈的3'端；它不可能獨自開始一個新的鏈。另一種DNA聚合酶的功能是錯誤校正 - 校正新DNA鏈中出現的錯誤。整個DNA聚合酶家族包括7個不同的亞組：A、B、C、D、X、Y和RT。真核生物至少有15種不同的DNA聚合酶。然而，真核聚合酶都不能去除引物，只有延伸聚合酶可以校對序列。
儘管存在不同型別的DNA聚合酶，但它們都具有共同的結構特徵。此外，即使DNA聚合酶在細節上差異很大，但它們在總體形狀上非常相似。已經鑑定出至少5個結構類別的DNA聚合酶。它們呈手的形狀，具有特定的區域，稱為手指、手掌和拇指。在所有類別的DNA聚合酶中，拇指和手指包裹著DNA，將其固定在酶的活性位點，而手掌釋放構成該活性位點的殘基。此外，所有DNA聚合酶在催化反應時都使用類似的策略。
DNA聚合酶是逐步將脫氧核苷酸單元新增到DNA鏈中的催化劑。催化的反應是
(DNA)n + dNTP ↔ (DNA)n+1 + PPi
其中dNTP代表任何脫氧核苷酸，PPi是焦磷酸根離子。
1. 反應發生需要所有四種活化的前體，脫氧核苷酸5'-三磷酸dATP、dGTP、dCTP和dTTP，以及Mg2+離子。通常，兩種金屬離子將參與反應。一種將與引物相互作用，而另一種與dNTP相互作用。dNTP中殘基的羧酸根基團將兩種金屬離子固定到位。
2. 新的DNA鏈直接在已存在的DNA模板上構建。只有當進入的核苷酸三磷酸的鹼基與模板鏈的鹼基互補時，DNA聚合酶才能在形成磷酸二酯鍵中有效地作為催化劑發揮作用。換句話說，DNA聚合酶是一種酶，它透過將現有的DNA鏈作為模板進行解釋來合成產物，並將模板的互補序列生成到新的鏈中。
3. DNA聚合酶需要引物的存在才能開始合成。DNA聚合酶催化的延長鏈反應是生長鏈的3'OH末端對脫氧核苷酸三磷酸的最內層磷原子的親核攻擊。因此，從一開始，必須將具有遊離3'-OH基團的引物鏈與模板鏈結合。這種引物是透過RNA合成形成的。由於RNA可以在沒有引物的情況下形成，因此它啟動了DNA的合成。一旦形成互補DNA並啟動合成，RNA片段將被去除，然後替換為正確的DNA序列。磷酸二酯橋是從反應中形成的，並且釋放出焦磷酸。隨後焦磷酸水解產生兩個正磷酸離子（Pi），這有助於推動聚合反應向前進行。這種DNA鏈的延伸過程在5'-到-3'方向上進行。
4. 許多DNA聚合酶能夠去除錯配的核苷酸，作為DNA錯誤校正的一種方法。這些聚合酶具有獨特的核酸酶活性，使它們能夠透過單獨的反應消除不正確的鹼基。DNA聚合酶將反轉其方向一個鹼基對，切除不正確的鹼基以用正確的鹼基替換它，並繼續進行其餘的複製。由於這種3'到5'外切核酸酶活性，DNA複製具有非常高的可靠性。這個步驟過程也被稱為校對。然而，它並不完全完美，這就是為什麼自然突變和相關疾病仍然可能出現的原因。
DNA聚合酶在DNA合成中起著關鍵作用。如果沒有這些參與者，生命將不復存在。這些聚合酶是多亞基複合物，功能非常獨特。它需要不同的成分協同工作才能有效地發揮作用。聚合酶作用於單鏈鏈（特別是模板），以合成互補的鏈。在真核細胞中，有5個DNA聚合酶家族。這些可以編碼為不同的（多達15個）酶。對於DNA複製至關重要的是三種DNA聚合酶：聚合酶α-引發酶、聚合酶δ和聚合酶ε。這三種聚合酶在DNA鏈的複製叉處起作用。DNA鏈被MCM解旋酶解旋，該解旋酶是CMG複合物（Cdc45-MCM-GINS）的一部分。正是聚合酶α-引發酶啟動了前導鏈和滯後鏈的複製。正是這裡，RNA引物（大約10個核苷酸）被放置下來。
啟動後，聚合酶δ和ε被帶到複合物中並被拴住。它們的功能是提高不同酶的生產力。具體來說，Pol δ在滯後鏈上合成，而Pol ε在前導鏈上合成。這些聚合酶的作用是透過遺傳實驗發現的。對於Pol ε，在活性位點上放置了一個突變。這增加了酶活性的速率，並在活性區域留下了印記。透過使用報告基因，證明了Pol ε確實參與了前導鏈的合成。對Pol δ進行了相同的遺傳操作，以證明其在滯後鏈中的活性。
在鹼基的實現過程中，需要一致的正確性。幸運的是，每10,000個複製的鹼基對只發生一次摻入。但是，當它確實發生在DNA引物鏈中時，它必須從聚合酶中移出並進入外切核酸酶域。在那裡，它被校對並允許繼續穩定的域。[1]
作為生命活動的核心，聚合酶一直是結構和功能研究的重點。迄今為止，已經發現了 7 個不同的聚合酶家族（或結構域）。其中 5 個家族是真核細胞特有的，而其餘家族則在細菌和古細菌中獨有。這些聚合酶家族都具有一個核心結構，包括掌、指和拇指結構域。不同家族的聚合酶在核心結構的基礎上演化出不同的細胞功能。這 7 個家族分別用字母 A、B、C、D、X、Y 和逆轉錄酶來表示。A 家族包括 Pol I 聚合酶，負責修復核苷酸。該家族還包括岡崎片段，參與滯後鏈的複製。B 家族包括真核聚合酶 sigma、alpha 和 epsilon。C 家族包含聚合酶 III，其功能是 XXX。D 家族包括僅存在於古細菌中的聚合酶。X 家族和 Y 家族則包含參與修復的酶。
正如之前提到的，聚合酶是多亞基實體，因此它們非常複雜。其結構由一個大的催化亞基（屬於 B 家族的一部分）和許多其他小的亞基組成。B 家族聚合酶的結構是統一的：一個 N 端結構域，3’-5’ 外切核酸酶結構域，掌、指和拇指結構域；呈環狀結構。所有真核聚合酶的催化亞基被認為是相關的，並來自基因重複的共同祖先。但研究表明，ε 的催化亞基比其他兩個亞基更大，因為存在額外的序列。
獲得高解析度的結構對於進一步分析聚合酶至關重要。迄今為止，在確定構成聚合酶的不同亞基的結構方面已經取得了很大進展，但僅限於低解析度。第一個報道的結構是 Pol ε 的冷凍電鏡結構。研究人員的目標是獲得高解析度結構，因為它可以幫助進一步理解 DNA 合成的保真度以及所有真核細胞中保持的高度調控基因組。此外，它還可以用於設計遺傳實驗，以探索複合物之間和內部的相互作用。[2]
[1]
Bruno P. Klaholz 著“翻譯終止複合物中的分子識別與催化”。IGBMC（遺傳學與分子細胞生物學研究所），結構生物學與基因組學系，法國伊爾基希，F-67404。生物化學趨勢，2011 年 5 月，第 36 卷，第 5 期
[2]
“真核生物類別的晶體結構和功能分析”。Mol. Cell 14, 233-245。Kong, C. 等人（2004）