結構生物化學/蛋白質/熒游標記
熒游標記，有時被稱為熒光團，是任何能夠吸收光並在某些特定波長處發射光的分子。熒光團的型別多種多樣，從簡單的有機化合物到像綠色熒光蛋白這樣的大型蛋白質。熒游標記使我們能夠在生物環境中研究蛋白質。當特定波長的光照射到分子的生色團時，光子被吸收並激發電子到更高的能級。然後，電子回到基態。釋放的能量由公式 E = hν 決定，其中 h 是普朗克常數，ν 是光子的頻率。這種能量可以與發射光子的波長相關聯，它對應於可見光譜上的特定顏色。吸收波長和發射波長之間的差異稱為斯托克斯位移。大的斯托克斯位移通常是理想的，因為來自熒游標記的發射光可以更容易地從激發光中過濾出來。如 FITC（異硫氰酸熒光素）等熒光誘導分子被用於染色細胞，這使得能夠在熒光顯微鏡下觀察這些細胞。多種熒游標記可用於染色細胞的不同部分。熒光顯微鏡可以幫助確定特定蛋白質在細胞中的位置。人們甚至可以跟蹤這些蛋白質的運動，並推斷出這些目標蛋白質的可能功能。
綠色熒光蛋白（GFP）是一種熒光蛋白，存在於水母Aequoria victoria中。在生物化學中，它經常被用作標記來監測基因表達和細胞分裂。天然存在的 GFP 在 395 nm 處有一個主要吸收峰，在 475 nm 處有一個次要吸收峰。它有一個 508 nm 的發射峰。這意味著當暴露在藍光下時，它會發射發出綠光的 photons，因此得名綠色熒光蛋白。
綠色熒光蛋白由 238 個氨基酸組成。它呈桶狀，稱為 β-桶，由 11 個 β-鍊形成蛋白質的壁，一個 α-螺旋貫穿中心。β-桶的直徑為 30Å，長度為 40Å。在分子中心是疏水性熒光團，它是蛋白質中負責吸收和發射光的部分。熒光團由三個氨基酸組成：絲氨酸、酪氨酸和甘氨酸，分別位於 65、66 和 67 位。[1]
為了使用熒光顯微鏡觀察目標蛋白，必須將 GFP 的基因剪接到編碼目標蛋白的 RNA 轉錄本中。無論該基因在何處表達以產生這種蛋白質，GFP 將與其一起產生。這些目標蛋白現在在熒光顯微鏡下觀察時會發出熒光。
熒光團在催化過程中透過順序機制產生。催化反應的啟用不需要輔助因子。反應由 Ser65 和 Gly67 之間的快速環化啟動，形成咪唑啉-5-酮中間體，然後是 Tyr66 側鏈被 O2 氧化的速度更慢的限速步驟，時間尺度為數小時。Gly67 是形成熒光團所必需的，沒有其他氨基酸可以替代該位置的 Gly。此處的反應對熱敏感。當溫度升高到 30oC 以上時，熒光團的形成率會下降。一旦 GFP 產生，GFP 就會轉變為熱穩定的狀態。
當熒光分子被引入基因組時，它們往往具有光毒性，這會導致細胞在熒光分子活性時死亡。大多數小的熒光分子都具有一定程度的光毒性，例如 FITC（異硫氰酸熒光素）。由於 GFP 的三肽熒光團是由氧氣啟用的，因此不需要新增酶。這種氧氣啟用特性使目標細胞受到的干擾較少，從而導致 GFP 在活細胞中使用時危害較小。這使得 GFP 可以維持在基因組中。
另一種用於定位蛋白質的方法是將 GFP 與抗體結合，該抗體將與目標蛋白質結合。直接方法將熒光抗體與目標蛋白質上的相應抗原結合。間接方法首先在目標蛋白質上結合非熒光抗體。然後引入熒光抗體，它將與非熒光抗體結合。儘管可以直接染色細胞的特定部分，但由於親和力高，間接方法是優選的。然後使用熒光顯微鏡，可以研究現在發光的目標細胞。
GFP 的應用不僅限於監測基因表達和細胞調節。鋅和一氧化氮等無機物質是幫助驅動生理過程的重要物質。因此，研究和視覺化這些無機物質如何在細胞內相互作用和被加工非常有價值。對於鋅，有許多開啟感測器提供了在細胞內視覺化鋅離子的良好方法。大多數使用的鋅指示劑是基於強度的感測器，因此對鋅指示劑的響應建立了熒光發射的強度。另一方面，一氧化氮由於其氣態性質、有限的水溶性和其他限制，更難以監測。解決此挑戰的一種方法是使用對一氧化氮敏感的蛋白質的遺傳編碼，這些蛋白質具有過渡金屬一氧化氮反應位點。例如，將兩個突變的 GFP 融合在一起用作一氧化氮指示劑。從某種意義上說，人們可以操縱 GFP 用作指示劑，從而為理解訊號網路的組織和調節提供更多可能性。[2]
綠色熒光蛋白也用於 FRET（熒光共振能量轉移）的體內技術，這是一種用於理解蛋白質之間相互作用的成像方法。在 FRET 中，測量了來自熒光蛋白（“供體”）到另一個波長更長的熒光蛋白（“受體”）的能量轉移。透過測量與 GFP 結合的蛋白質之間的分子間和分子內距離，研究人員能夠觀察和記錄蛋白質的相互作用。例如，FRET 使我們能夠檢測訊號分子之間的相互作用。透過將對 FRET 供體和受體蛋白質之間的構象變化敏感的蛋白質定位在 FRET 供體和受體蛋白質之間，我們可以確定該途徑的活性。[3]
基於金屬的熒光探針已被開發為一種檢測系統中 NO 的存在的方法；NO 是一種與生物體中的訊號通路相關的突出化合物。這些基於金屬的熒光指示劑基於金屬 Cu(II)。當 Cu(II) 離子與 NO 反應時，Cu(II) 被還原為 Cu(I)。這個過程導致一氧化氮氮原子上的孤對電子的猝滅能量減少；反應導致氮原子上的孤對電子的熒光強度降低。此外，系統中發生的 Cu(II) 與 NO 之間的反應也導致 N-亞硝胺中 PET 猝滅的降低。基於 Cu(II) 的熒光探針非常適合檢測存在於不含氧環境中的 NO。一種特定利用 Cu(II) 離子識別 NO 的熒光素染料是 CuFL1 平臺。該特定支架中的熒光素染料具有氨基喹啉（喹啉的衍生物），它與 Cu(II) 結合並形成 16 倍的發射開啟。該反應將氨基喹啉的仲胺轉化為 N-亞硝基化產物，這加強了分子的熒光；熒光強度的增加基於 NO 的濃度。CuFL 探針已經確定了 Raw 264.7 巨噬細胞和某些革蘭氏陽性細胞（如枯草芽孢桿菌和炭疽桿菌）中 NO 的存在。[4]
熒游標記物常用於 DNA 研究中，以確定鏈中鹼基的序列。這種方法的優點是不像西方印跡中那樣使用放射性試劑進行自顯影。因此，它已成為一種非常流行的 DNA 測序方法。在弗雷德里克·桑格及其同事設計的一種方法中，使用 DNA 聚合酶在四种放射性標記核苷酸的混合物中建立單鏈 DNA 分子的互補鏈。該合成中包含了一種混合物，其中包含核苷酸的 2',3'-二脫氧類似物，每種混合物使用不同的類似物。混合物中的 2',3'-二脫氧類似物會導致 DNA 複製終止，從而產生片段。這是因為該類似物沒有 3' 羥基末端以促進磷酸二酯鍵合。然後，這些混合物進行電泳，透過放射自顯影圖讀取鹼基序列。使用熒游標記物，在二脫氧類似物中將不同的彩色標籤附著到每個鹼基上，而不是進行放射性標記。然後，這些片段進行相同的電泳。透過其熒光檢測所得條帶，顏色序列隨後被翻譯成鹼基序列。使用這種方法，現代測序工具每天可以測序超過 100 萬個鹼基。[5]
熒光蛋白報告基因
[edit | edit source]正在開發熒光蛋白 (FP) 報告基因的策略，這些策略“講”細胞的語言，使科學家能夠了解以前無法觀察到的複雜生化過程網路。目前製造了三種主要型別的 FP。第一種是與蛋白質結合以報告其位置和週轉的 FP；第二種是旨在改變熒光訊號的 FP，使科學家能夠知道何時發生了變化或與他們正在研究的蛋白質之間的分子間相互作用。最後，還有一些 FP 包含一個感覺元件，可以檢測小分子的積累或降解。然後使用這些 FP 報告基因來了解標記的訊號分子的行為及其時空組織。
在正常的訊號通路中，質膜上的受體檢測細胞外訊號並介導細胞內第二信使的產生，這些第二信使然後調節訊號酶和下游轉錄因子的活性。這些報告基因使科學家能夠觀察蛋白質在其自然環境中的反應，無論它是否穿過膜擴散或需要膜上的受體來發送資訊。可以使用 GFP 觀察這些，GFP 的熒光隨時間推移會改變顏色，或者可以光啟用。這種方法允許直接顯示細胞內負責觀察到的作用的分子。FP 的最大好處是它們能夠保持離散並且不干擾細胞功能的通路。[6]
量子點
[edit | edit source]參考資料
[edit | edit source]- ↑ Tsien，Roger Y. "綠色熒光蛋白。”Annu. Rev. Biochem. 67 (1998): 509-44。
- ↑ Lippincott-Schwartz，J. "使用熒光成像進行細胞功能的新興體內分析。”Annu. Rev. Biochem. 80 (2011): 327-332。
- ↑ Lippincott-Schwartz，J. "使用熒光成像進行細胞功能的新興體內分析。”Annu. Rev. Biochem. 80 (2011): 329-330。
- ↑ Pluth，M.D；Tomat，E.；Lippard，S. J. 熒光感測器揭示了移動鋅和一氧化氮的生物化學。”Annu. Rev. Biochem. 80 (2011): 333-355。
- ↑ Berg，Jeremy M.，Lubert Stryer 和 John L. Tymoczko。生物化學。第 6 版。波士頓：W. H. Freeman & Company，2007 年。138-139。
- ↑ Lippincott-Schwartz，J. "使用熒光成像進行細胞功能的新興體內分析。"Annu. Rev. Biochem. 80 (2011): 327-332。