結構生物化學/蛋白質/凝膠電泳
凝膠電泳是一種用於顯示和確定純化方案是否有效的技術，方法是測量混合物中不同蛋白質的數量。凝膠電泳的基礎是具有特定淨電荷的分子將在電場中移動。蛋白質遷移的速度可以量化為
其中E為電場強度，z為蛋白質的淨電荷，f為摩擦動力系數。
對於球形分子，摩擦係數確定為
f = 6 π η r
其中 η 為粘度。
正如其公式所示，分子在凝膠基質中移動的速度取決於其大小、形狀和電荷。分子越小，移動越快。此外，凝膠可以製成各種 wt 百分比：6%、8%、10%、12% 和 15%。較高的百分比主要用於較小的分子，較低的百分比用於較大尺寸的樣品。理論上，較大的分子仍然可以使用較高的百分比，但這些凝膠可能需要很長時間才能顯影。電荷也可能是特定樣品在凝膠中遷移的速度和距離的因素。使用較高的電壓將使樣品移動得更遠更快。但是，在使用較高電壓時必須謹慎，因為它產生的熱量可能會融化凝膠。
凝膠電泳（SDS-PAGE；SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳）是一種檢查樣品純度的強大工具，因為它可以檢測微量的蛋白質。不同的蛋白質在凝膠用考馬斯亮藍染色（視覺化約 2 pm 的蛋白質）或銀染色（視覺化 0.02 µg 的蛋白質）後會出現在 SDS-聚丙烯醯胺凝膠上，形成不同的條帶。
天然凝膠電泳涉及用樣品在其天然狀態下執行凝膠。這樣，分子的電荷除了大小之外也成為一個因素。更具體地說，帶電荷更多的分子將比具有可比質量的帶電荷更少的分子遷移得更快、更遠。同樣，較大的分子將比具有可比電荷的另一個分子遷移得更少、速度更慢。天然凝膠電泳最常涉及兩種型別的凝膠——瓊脂糖和聚丙烯醯胺。瓊脂糖是紅藻細胞膜的衍生物，由多糖瓊脂糖和瓊脂膠組成，由於孔徑較大，瓊脂糖凝膠更適合於大於 200 千道爾頓的蛋白質樣品。聚丙烯醯胺（聚 2-丙烯醯胺，是一種易於交聯的神經毒素丙烯醯胺的聚合物。它的孔更細，雖然瓊脂糖最常用於大多數情況下，但聚丙烯醯胺是較小樣品質量的首選凝膠。
電泳涉及顆粒（如核酸或肽）在電場中由於電荷所受力的影響而透過介質的運動。電泳可以利用分子大小差異或電荷差異來分離相似的分子，並且分離量可以透過改變施加的電壓或固定介質的密度來進行細化。SDS-PAGE 是一種用於根據大小分離蛋白質的技術，並且僅根據大小分離。十二烷基硫酸鈉 (SDS) 是一種表面活性劑，在其序列中每 2 個氨基酸與蛋白質結合，並且由於 SDS 本身非常負電，它將分子的總電荷改變為負電荷。這種負電荷與蛋白質的質量成正比，因為與分子結合的 SDS 數量取決於存在多少個氨基酸雙體。施加到蛋白質的負電荷遠大於原始電荷，這使得不同蛋白質之間的電荷與質量比基本相同。當 SDS 與蛋白質結合時，它還透過使蛋白質變性和改變其鍵來使蛋白質構象改變為相似的形狀。SDS 允許凝膠電泳根據蛋白質的分子量分離蛋白質，因為蛋白質之間的質量與電荷比相對一致。這是因為 SDS 凝膠具有篩分特性（根據顆粒的大小提供阻力）並且是統一的環境。它增加了微分遷移率。這些蛋白質的遷移率與其質量的對數成線性關係。利用這些資訊，我們可以從它們的遷移率推斷蛋白質的質量，甚至可以區分質量差異 2% 的蛋白質。因此，質量最大的分子，即與它們結合了更多 SDS 的分子，將在電場中比質量更小、與它們結合了更少 SDS 的分子下降得慢。這一原理與尺寸排阻（凝膠過濾）色譜相反，尺寸排阻色譜使較重的分子先出來，而較輕的分子後出來。
某些溶劑，如 PEG、甘油、乙醇和異丙醇，透過減少提供蛋白質水合球的自由水量來降低蛋白質的流體力學半徑。極性溶劑將與水形成氫鍵，減少蛋白質周圍的無序，從而減小水合球的尺寸。在這種情況下，蛋白質將在後期洗脫，就好像它們尺寸更小一樣。
該過程完成後，蛋白質用染料染色，形成條帶，代表每種蛋白質的遷移率層。隨著每一步純化過程的增加，電泳產生的條帶越來越少，但一個單一的更深的條帶，它代表著正在分離的蛋白質的濃度增加。
SDS-PAGE 和等電聚焦的分離技術可以結合使用，以允許進行 2DGE，它在蛋白質分離中採用更高的解析度和靈敏度。這種強大技術的第一個維度是等電聚焦 (IEF)，第二個維度是聚丙烯醯胺凝膠電泳 (PAGE)。在第一個維度中，蛋白質根據它們的等電點 (pI) 進行分離。為此，將凝膠塗抹到 SDS-聚丙烯醯胺板的頂部。然後，在水平方向上對凝膠施加電泳，蛋白質遷移到第二個維度凝膠中。然後再次施加電泳，這一次垂直穿過凝膠板，蛋白質將根據其分子量遷移。較重的蛋白質將移動更短的距離。相反，較輕的蛋白質將移動得更遠。
雖然二維凝膠電泳是一種強大的技術，它呈現出更高的分離解析度，但它也有一些侷限性。2DGE 是一種耗時且勞動密集的過程，需要人工凝膠聚合、染色以及數小時的分離。此外，該技術並非沒有風險。由於凝膠的加熱可能會導致凝膠表面分子的翹曲和擴散，因此 2DGE 難以重現。
DNA 指紋識別是一種用於區分不同生物體的技術，方法是根據每個生物體的 DNA 配置之間的差異來區分。DNA 指紋識別通常由法醫實驗室使用，方法是將嫌疑人的 DNA 與在犯罪現場發現的 DNA 進行比較，以識別罪犯。來自嫌疑人的 DNA 透過凝膠電泳執行，並與在現場發現的 DNA 樣本進行比較。如果兩個樣本在凝膠中產生相同的條帶模式，那麼可以確認嫌疑人在犯罪現場，因為沒有兩個人擁有完全相同的 DNA 模式。
為了進行指紋識別，必須從每個待評估的生物體中獲取包含 DNA 的樣本。DNA 樣本的例子包括血液、尿液、唾液、皮膚或毛髮。在分析樣本之前，必須先對其進行製備。製備包括使用限制性內切酶將 DNA 分解成更小的片段。限制性內切酶是能夠在特定核苷酸處切割 DNA 鏈的酶。這些核苷酸被稱為限制性位點，通常標誌著一個由 4 到 8 個核苷酸組成的序列的末端。每個限制性序列的成分和長度因人而異，因此使用限制性內切酶是將生物體的 DNA 分割成獨特且特定片段的有效方法。此外，還會向凝膠中加入一定量的化學物質作為染料，這些染料在紫外線下會發光。這使得在分析樣本蛋白質時更容易觀察到條帶。
包含許多不同短重複序列的 DNA 區域被稱為微衛星。這些微衛星的長度因人而異，這使得它們成為限制性內切酶切割 DNA 的最佳位置。用限制性內切酶處理 DNA 樣本後，DNA 就準備好了進行分析。將樣本載入到凝膠板的孔中，並施加電流。較小的 DNA 片段在凝膠中移動得更快，因此會更靠近底部，而較大的片段會更靠近頂部。如果同時執行兩個 DNA 樣本，可以比較條帶的位置。如果兩個樣本的條帶模式相同，則意味著限制性內切酶在相同位置切割了每個樣本的 DNA，表明兩個 DNA 樣本具有相同的核苷酸序列。相同的核苷酸序列表明兩個樣本來自同一個生物體。
指紋識別也是確定兩個人是否相關的有用技術。雖然沒有兩個人擁有相同的 DNA 模式，但微衛星的某些部分會從父母傳給孩子。並不是所有這些部分都會被遺傳下來，但後代不會包含任何父母沒有的模式。可以透過比較相關個體的指紋來進行親子鑑定。如果在每個樣本的指紋中重複出現大量模式組，則這些個體很可能存在親緣關係。嵌入的影像包含三個不同的指紋，如三個不同的條帶模式所示。雖然這些模式代表來自不同人的指紋，但樣本 2 與樣本 1 和 3 共享相似的模式，這表明樣本 2 所代表的 DNA 的人很可能是樣本 1 和 3 的孩子。
母系和父系 DNA 指紋測試用於確定兩個人之間存在親緣關係的可能性。這些測試不能給出明確的答案，而且並非萬無一失。
凝膠中蛋白質的顯像
[edit | edit source]由於大多數蛋白質在凝膠上肉眼不可見，因此必須採用一種方法來在電泳後對其進行顯像。最常用的蛋白質染色劑是考馬斯亮藍。電泳後，將含有分離蛋白質的凝膠浸入染料的酸性酒精溶液中。這會使蛋白質變性，將其固定在凝膠中，防止其被洗掉，並允許染料與蛋白質結合。洗去多餘的染料後，蛋白質會顯示為離散的藍色條帶。使用考馬斯亮藍可以顯像凝膠中低至 0.1-1.0 µg 的蛋白質。一種更靈敏的通用蛋白質染色方法包括將凝膠浸泡在銀鹽溶液中。然而，這種技術應用起來比較困難。如果蛋白質樣本具有放射性，可以透過將凝膠覆蓋一張 X 射線膠片來間接顯像蛋白質。隨著時間的推移（根據樣本蛋白質的放射性，從幾小時到幾周不等），發射的輻射會使膠片變黑。在顯影后，所得的放射自顯影圖將具有與放射性標記蛋白質位置相對應的暗區。另一種顯像目標蛋白質的方法是在免疫印跡（Western blot）中使用針對該蛋白質的抗體。對於這種技術，蛋白質必須從凝膠中轉移到硝基纖維素或尼龍膜上。這是透過將凝膠覆蓋在硝基纖維素上實現的，然後硝基纖維素上會出現凝膠中模式的精確影像。然後用非特異性蛋白質溶液（例如牛奶粉）阻斷硝基纖維素上多餘的結合位點，然後再將其放入含有識別目標蛋白質的抗體（一抗）的溶液中。去除過量的未結合抗體後，現在特異性結合到目標蛋白質上的抗體可以用放射性標記、熒光或酶偶聯的二抗進行檢測。最後，透過將硝基纖維素放置在一張 X 射線膠片上（如果使用了放射性標記的二抗），使用熒光檢測器，或者透過在硝基纖維素中加入能夠被偶聯到二抗上的酶轉化為有色不溶性產物的底物溶液，來檢測二抗。
參考文獻
[edit | edit source]Hames, David. Hooper, Nigel. Biochemisty. 第三版. Taylor and Francis Group. 紐約. 2005.
http://www.sciencebuddies.org/science-fair-projects/project_ideas/BioChem_p009.shtml